低温邻苯二甲酸二甲酯降解菌STX_2和STX_5的分离、鉴定及降解特性*

张 可 关 允 格 桑 罗鸿兵 陈 伟 陈 佳 陈 强

(1.四川农业大学土木工程学院，四川 都江堰 611830; 2.哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090; 3.四川农业大学资源学院，四川 成都 611130)

低温邻苯二甲酸二甲酯降解菌STX_2和STX_5的分离、鉴定及降解特性*

张 可1关 允2格 桑2罗鸿兵1陈 伟1陈 佳1陈 强3

(1.四川农业大学土木工程学院，四川 都江堰 611830; 2.哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090; 3.四川农业大学资源学院，四川 成都 611130)

在高海拔、低气温地区分离得到两株以邻苯二甲酸二甲酯(DMP)为碳源的菌株STX_2和STX_5。经鉴定，STX_2和STX_5分别为假单胞菌属(Pseudomonas)和红球菌属(Rhodococcus)菌株。在单菌试验的基础上，对混菌降解DMP的条件进行了优化。结果表明，混菌在温度为15 ℃、初始pH为8、140r/min振荡培养72h的条件下，对1 000mg/L的DMP降解效果最好，4种表面活性剂并不能显著提高混菌降解DMP的效果。动力学试验表明，随着DMP初始浓度的增加，降解速度常数降低，半衰期变长。混菌对短链邻苯二甲酸酯(PAEs)降解效果较好，而对长链PAEs降解效果较差。

低温 邻苯二甲酸二甲酯 生物降解 分离 鉴定

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类重要的有机化合物，被广泛用作塑料助剂、油漆溶剂、合成橡胶增塑剂。由于其在工业生产中大量使用，当前PAEs已普遍存在于土壤、水体、大气等环境介质中[1_2]。PAEs是一类环境内分泌干扰物，其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)等对动物生殖系统具有严重的危害性，还对人体具有致癌风险[3]。PAEs在自然条件下的水解和光解速率很缓慢，微生物降解是其在自然环境中完全矿化的主要途径[4]。近年来，PAEs微生物降解的研究工作主要针对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，已分离出的DBP降解菌有红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)等[5_6]。对于DMP的降解菌研究相对较少，低温条件下降解DMP更加困难，还未见相关研究报道。

本研究在高海拔的低温地区河流沉积物中分离得到两株以DMP为碳源的菌株，分别进行16S rDNA和邻苯二甲酸双加氧酶基因扩增、T/A克隆鉴定。在单菌降解DMP试验的基础上进行混菌培养，研究了其在不同温度、初始 pH、表面活性剂条件下的DMP降解特性，以期为低温条件下DMP等PAEs的微生物修复提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 沉积物样品采集

沉积物样品采集于四川省阿坝州茂县土门乡境内，该区域海拔高、气温低，最高海拔达3 200 m，年均气温为11.0～13.7 ℃。采用多点采样法采集样品，混合后4 ℃保存。

1.2 培养基的配制

无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O 0.40 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，K2HPO41.50 g，KH2PO41.50 g，FeSO4·7H2O 0.04 g， NaNO30.50 g，(NH4)2SO41.00 g，FeCl30.15 g，H2O 1 000 mL。

LB液体培养基:酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 mL，调节pH=7。

在无机盐液体培养基和LB液体培养基的配方中加入20 g 琼脂即制成相应的固体培养基。PAEs浓度根据实际需要加入到无机盐液体培养基中。

1.3 菌株分离与纯化

称取5 g沉积物样品，置于DMP质量浓度为200 mg/L的无机盐液体培养基中。于140 r/min、15 ℃条件下培养7 d，以10%(体积分数，下同)接种量转接至DMP质量浓度为400 mg/L的无机盐液体培养基中，重复上述培养和接种过程，逐渐提高无机盐液体培养基中的DMP质量浓度至1 000 mg/L。再转接至LB液体培养基中富集，取富集液涂布在含1 000 mg/L DMP的无机盐固体培养基上，在15 ℃恒温箱培养至长出单菌落，挑取12个单菌落转接至含DMP 1 000 mg/L的无机盐液体培养基中，于140 r/min、15 ℃条件下培养，筛选出DMP降解效果最好的两个菌落，分别编号为STX_2和STX_5，并转接至LB固体培养基，4 ℃保存。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 菌株的生理生化

用镜检法观察菌体形态。生理生化鉴定参见文献[7]，其中乙酰甲基甲醇试验采用Barritt氏法，吲哚试验采用Ehrlich法。

1.4.2 DNA提取与聚合酶链式反应(PCR)扩增

采用DNA提取试剂盒提取菌组的16S rDNA。PCR扩增采用细菌通用物27F(5’_AGAGTTTGATCCTGGCTCAG_3’)和1492R(5’_TAGGGCTACCTTGTTACGACTT_3’)。扩增体系:PCR Mix 15 μL，DNA模板1 μL，引物各0.2 μL，超纯水补足至30 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。

1.4.3 克隆测序

将PCR扩增产物用Universal DNA纯化回收试剂盒纯化后与pGM_T载体连接，转入大肠杆菌DH_5α感受态细胞，通过氨苄抗性及蓝白斑初步筛选阳性克隆进行测序。利用BLAST软件在GenBank中进行同源性比对，利用Neighboring_joining 方法在MEGA 6.0软件中进行系统发育树构建。

1.5 菌株邻苯二甲酸双加氧酶基因的克隆

利用正向引物5’_ACACSCCBCARACSCACAC_3’和反向引物5’_CTTGTCCTGCTACAGCTCTTG_3’进行菌株邻苯二甲酸双加氧酶基因的PCR 扩增[8_9]。扩增体系:PCR Mix 15 μL，DNA模板1 μL，引物各0.1 μL，超纯水补足至25 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。 PCR扩增产物的回收、连接、转导、克隆、测序方法同 1.4.3节。

1.6 DMP降解试验

将LB固体培养基上的单菌落转接至LB液体培养基中，于140 r/min、15 ℃条件下培养36 h后离心收集菌体，用不含DMP的无机盐液体培养基重悬，作为母液。均以1%的接种量接种STX_2和STX_5，加入到含不同浓度DMP的无机盐液体培养基中培养，并定时测定培养基在600 nm处的光密度(OD600)，用于表征菌株生物量，同时测定DMP浓度并计算降解率。分别考察温度、初始pH、表面活性剂对DMP降解特性的影响。同时，考察混菌降解DMP动力学过程和混菌对其他PAEs的降解效果。

采用Aglient 1200系列的高效液相色谱仪(HPLC)测定DMP的浓度。色谱柱为Inertsil ODS_2151_K(6 mm×150 mm)，柱温为40 ℃，流动相为甲醇∶水(体积比为90∶10)，流速为0.5 mL/min，进样量为20 μL。采用UV_1800紫外—可见分光光度计测定OD600。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定结果

STX_2菌体呈椭圆形、无芽孢，菌落为圆形、淡黄色、表面湿润光滑、边缘规则；STX_5菌体呈短杆状，菌落为圆形、橙红色、不透明、表面湿润光滑。其他生理生化特性见表1。

表1 菌株STX_2和STX_5的生理生化特性1)

注:1)+表示阳性；_表示阴性。

图1 菌株16S rDNA 系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strains by 16S rDNA

图2 菌株邻苯二甲酸双加氧酶基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strains by phthalate dioxygenase gene

菌株STX_2和STX_5的16S rDNA分别获得1 433、1 344 bp，GenBank登录号分别为KR611863、KR611864，构建系统发育树如图1所示。从图1可以看出，STX_2与异化硝酸盐还原菌(Pseudomonasalcaliphila) JCM 10630(GenBank登录号为AB030583)相似性为100%，归属于假单胞菌属；STX_5与带化红球菌(Rhodococcusfascians) ATCC 12974(GenBank登录号为X79186)相似性为100%，归属于红球菌属。假单胞菌属广泛存在于环境中。近年来，具有污染物降解能力的假单胞菌不断被人们从环境中分离出来。张宏波等[10]从多环芳烃污染土壤中分离出能高效降解芘的3株假单胞菌属菌株。王继华等[11]从曝气池污泥中分离到能降解苯胺的假单胞菌属菌株。对于红球菌属菌株在低温条件下对污染物的降解目前主要报道的是对氯氰菊酯和苯酚类污染物[12]。

2.2 菌株邻苯二甲酸双加氧酶基因的克隆与分析

菌株STX_2和STX_5的邻苯二甲酸双加氧酶基因构建系统发育树，结果见图2。STX_2和STX_5的邻苯二甲酸双加氧酶基因序列与施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) (GenBank登录号为U26262)、RhodococcusDK 17(GenBank登录号为AAR90178)质粒上编码邻苯二甲酸双加氧酶的基因序列相似度分别为99%、100%，说明STX_2和STX_5与目前报道的微生物好氧降解DMP机制相吻合[13_15]。

2.3 环境因子对混菌降解DMP的影响

2.3.1 温度对混菌降解DMP的影响

在初始pH为7、140 r/min振荡培养72 h条件下，考察温度对混菌降解1 000 mg/L 的DMP的效果，结果如图3所示。由图3可见，经72 h培养后，温度为15 ℃的条件下，混菌对DMP的降解率最高，达到76.3%。以往对PAEs降解菌的研究中，分离出的菌株最适降解温度通常为25～37 ℃，在低温10～20 ℃的条件下降解率很低。金雷等[16]101曾从长期受垃圾污染的土壤中分离出1株DBP降解菌，在30 ℃时降解率最高。因此，菌株STX_2和STX_5适合在海拔高、气温低的地区降解DMP等PAEs。

图3 温度对混菌降解DMP的影响Fig.3 Effect of temperature on DMP degradation by strains

2.3.2 初始pH对混菌降解DMP的影响

在15 ℃、140 r/min振荡培养72 h的条件下，考察了初始pH对混菌降解1 000 mg/L的DMP的影响。由图4可见，在pH为8时， 混菌对DMP的降解率最高，达89.4%。混菌在碱性条件下对DMP的降解率明显高于酸性条件，这可能与菌株在降解DMP过程有邻苯二甲酸、原儿茶酸等酸性物质产生有关[17]。在单菌降解DPM试验时发现，两种菌株均在pH为7时具有最高降解率，混菌的最适pH向碱性偏移。在相同条件下，混菌对DMP降解率高于单菌，推测可能是由于红球菌在降解过程中产生的酸性中间产物正好可被假单胞菌利用[16]106，对反应体系中的pH起到缓冲作用。目前已有研究发现，菌株组合能促进污染物的降解，但其相互关系仍不清楚，其筛选和组合仍是一个相对随机的过程，有待进一步研究。

图4 初始 pH对混菌降解DMP的影响Fig.4 Effect of initial pH on DMP degradation by strains

2.3.3 表面活性剂对混菌降解DMP的影响

DMP水溶性低、微生物可利用性差，表面活性剂可强化其微生物降解性能。DAS 等[18]研究印度东北部石油烃污染土壤中枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌产生的生物表面活性剂(BS)对多环芳烃的降解效果时发现，加入 BS后芘溶解度提高5 倍，微生物降解效果明显提高。众多研究表明，鼠李糖脂对污染物的微生物降解均有促进作用[19_20]。在15 ℃、初始pH=8、140 r/min振荡培养72 h的条件下，考察4种不同浓度的表面活性剂(质量分数为0～3%)对混菌降解800 mg/L的DMP的影响，结果见图5。由图5可见，十二烷基硫酸钠(SDS)和鼠李糖脂质量分数为1%～3%时与0相比，均表现出显著抑制作用。1%的曲拉通和吐温_80可以提高混菌对DMP的降解率，但影响不大；2%、3%的曲拉通和吐温_80反而表现出显著的抑制作用。因此，本研究所研究的4种表面活性剂并不能显著提高混菌降解DMP的效果。

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著，图7同。

图5表面活性剂对混菌降解DMP的影响
Fig.5 Effect of surfactant on DMP degradation by strains

2.4 混菌对DMP的降解动力学

为了解混菌对DMP的降解动力学，在15 ℃、pH=8、140 r/min、不添加表面活性剂的条件下，对其在不同浓度DMP中的降解特性进行了考察，降解曲线见图6。对曲线按一级反应动力学方程(见式(1))进行拟合。

lnc=_kt+A

(1)

图6 混菌对不同初始质量浓度DMP的降解曲线Fig.6 Degradation curve of different DMP concentrations by strains

式中：c为DMP质量浓度，mg/L；k为降解速率常数，h_1；t为时间，h；A为常数。

半衰期根据式(2)进行计算。

t1/2=ln2/k

(2)

式中：t1/2为半衰期，h。

混菌对不同初始质量浓度DMP的降解动力学参数如表2所示。由表2可以看出，随着DMP初始浓度的增加，降解速度常数降低，半衰期变长。

表2 混菌对不同初始质量浓度DMP的降解动力学参数

2.5 混菌对其他PAEs的降解效果

为了测定混菌对其他PAEs的降解效果，将其分别接种到含800 mg/L的DBP、邻苯二甲酸二(2_乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸(PA)、邻苯二甲酸二异丁酯(DINP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)的无机盐液体培养基中，在15 ℃、pH=8、140 r/min、不加表面活性剂的条件下培养60 h时后，对OD600进行测定，结果如图7所示。混菌在含DEHP、DINP、DOP的无机盐液体培养基中培养后OD600小于0.35，而在含DBP、DEP、BBP、PA的无机盐液体培养基中OD600高于0.58，说明混菌能利用短链PAEs，但长链PAEs对混菌有抑制作用，且不同的长链PAEs(DEHP、DINP、DOP)具有显著差异(P<0.05)。FANG等[21]也发现，PAEs降解菌能快速降解短链的DMP、DEP，而对长链的DEHP降解速率很慢。

图7 混菌对其他PAEs的降解效果Fig.7 Degradation effects of strains on other PAEs

3 结 论

(1) 从高海拔、低气温地区分离到两株以DMP为碳源的菌株STX_2和STX_5，经鉴定分别为假单胞菌属和红球菌属。

(2) 混菌在温度为15 ℃、初始pH为8、140 r/min振荡培养72 h的条件下，对1 000 mg/L的DMP降解效果最好，4种表面活性剂并不能显著提高混菌降解DMP的效果。

(3) 动力学试验表明，随着DMP初始浓度的增加，降解速度常数降低，半衰期变长。

(4) 混菌对短链PAEs降解效果较好，而对长链PAEs降解效果较差。

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Isolation,identificationanddegradationcharacteristicsofdimethylphthalatedegradationstrainsSTX_2andSTX_5atlowtemperature

ZHANGKe1,GUANYun2,GESang2,LUOHongbing1,CHENWei1,CHENJia1,CHENQiang3.

(1.CollegeofCivilEngineering,SichuanAgriculturalUniversity,DujiangyanSichuan611830;2.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,HarbinHeilongjiang150090;3.CollegeofResources，SichuanAgriculturalUniversity,ChengduSichuan611130)

Two strains (STX_2 and STX_5) capable of utilizing dimethyl phthalate (DMP) as carbon source were isolated from high altitude area with low temperature. STX_2 and STX_5 were identified asPseudomonasandRhodococcus,respectively. Based on single strain test,DMP degradation conditions were optimized for mixed strains. Results showed that the best degradation conditions for 1 000 mg/L DMP were temperature of 15 ℃,initial pH of 8,140 r/min of 72 h. Four surfactants were inefficient to improve DMP degradation. Kinetic experiment revealed that as DMP initial concentration raised,degradation kinetic constants declined and half_time elongated. Mixed strains were easy to degradate short_chain phthalic acid esters (PAEs),but hard to degradate long_chain PAEs.

low temperature; dimethyl phthalate; biodegradation; isolation; identification

10.15985/j.cnki.1001_3865.2017.01.004

2016_01_18)

张 可，女，1982年生，硕士，讲师，主要从事环境微生物及市政污水处理研究。

*国家自然科学基金资助项目(No.51278318)；四川省科技支撑计划项目(No.2014NZ0044、No.2013SZ0103)。