海水养殖废水沉积物中硝化细菌的分离及修复无机氮污染的研究*

刘彦彦 许振成# 曾 东 陈峻峰 胡艳芳 张伟丽 胡立琼

(1.环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655；2.华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510006)

海水养殖废水沉积物中硝化细菌的分离及修复无机氮污染的研究*

刘彦彦1许振成1#曾 东1陈峻峰2胡艳芳1张伟丽1胡立琼1

(1.环境保护部华南环境科学研究所，广东 广州 510655；2.华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510006)

针对海水养殖废水中的无机氮污染，从某石斑鱼养殖池底沉积物中筛选出5株硝化细菌(5～9号)，并利用该菌进行去除养殖废水中无机氮的实验。结果表明，5株硝化细菌对养殖废水中氨氮、总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有去除作用，对硝酸盐氮的去除存在相对延滞。其中，7号菌株去除效果最好，6h时对氨氮、总氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为48%、17%和13%；36h对硝酸盐氮的去除率达18%。

养殖废水 硝化细菌 无机氮 生态修复

Abstract: For inorganic nitrogen pollution of mariculture wastewater，five nitrifying strains (number 5-9) were screened out from a grouper aquaculture bottom sediments. The five nitrifying strains had certain removal effect of ammonia，total nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen to the grouper aquaculture wastewater, however, there was a relative delay for the removal of nitrate nitrogen. The screened number 7 strains had a better removal efficiency of ammonia nitrogen, total nitrogen and nitrite nitrogen in short time，the removal efficiency was 48%，17% and 13% at 6 h;and the number 7 strains achieved 18% of the removal efficiency of nitrate nitrogen at 36 h.

Keywords: mariculture wastewater; nitrifying strains; inorganic nitrogen; biological remediation

近几十年来，我国的海水养殖产量呈逐年递增态势，水产养殖已成为我国农业的支柱性产业之一[1-2]。传统的水产养殖业已由小范围、分散经营向规模化、集约化方向发展[3-5]。污染的问题也随之产生，近海水域环境严重恶化，从而导致了近岸海域生态系统失衡，严重影响了水产养殖生态安全，制约了海水养殖业的可持续发展[6]。海水养殖废水污染主要来源于残剩饲料、养殖体排泄物、各类化学药品等，主要污染元素为氮、磷和有机物[7]。海水养殖废水具有两个明显的特点：潜在污染物含量低、水量大和废水分布分散。水产养殖过程中，水体的氨、硝酸盐、亚硝酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化情况频繁出现[8-12]。除了会改变水质与生物平衡外，氨氮和亚硝酸盐氮等毒性较高会对水生动物造成严重影响[13-16]。目前，海水养殖修复技术主要包括3类：物理、化学和生物修复。常见物理修复有底泥疏浚、换水、曝气、筛网、泼撒沸石灰等，但这类方法常需要较高的投资和运转费用，并且处理效果不彻底[17]；化学修复主要是运用水质改良剂、水质消毒剂和杀藻剂等改善养殖环境，但化学修复剂易产生有害的次生产物，使得水生态系统健康状况恶化，水产品品质退化[18]；生物修复是指生物尤其是微生物催化降解环境污染物，减少或消除环境污染的自发过程[19-22]。微生物法是一种较理想的方法，由微生物引起的硝化-反硝化作用是水中氮素释放的重要机制之一[23-25]。

目前，已知的硝化细菌大多是从淡水环境中分离得来，能用于海水养殖中水处理的报道较少[26-29]。硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养细菌，是生物硝化中起主要作用的微生物，污水中硝化细菌的含量与硝化速度成正比关系[30-31]。因此，硝化细菌具有良好的净化水质的效果，可用于海水养殖生物修复过程[32]。本研究从海水养殖废水沉积物中进行硝化细菌的筛选和分离，然后利用该菌种进行去除养殖废水无机氮的实验，从而为海水养殖废水无机氮污染的生物修复提供菌种储备和理论支持。

表1 养殖废水主要水质指标

1 材料与方法

1.1 菌株和废水来源

菌株分离样品采自海南省冯家湾区域某石斑鱼养殖池底沉积物，该养殖场地理坐标为110°41′43.6″E，19°24′31.0″N。将菌株分离样品装入无菌离心管中，放入冰盒中带回实验室4 ℃保存备用。实验用养殖废水取自该养殖池，主要水质指标见表1。

1.2 培养基

微量元素溶液：ZnSO42.2 g，CaCl2·2H2O 5.5 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，MnCl2·4H2O 5.0 g，Na2MoO4·4H2O 1.1 g，乙二胺四乙酸二钠63.7 g，去离子水1 000 mL组成。

亚硝酸细菌液体培养基：每升由NH4Cl 0.4 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、KH2PO41.5 g、CH3COONa 4.4 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL组成，pH为7.0～7.3。于121 ℃下灭菌20 min备用。

硝酸细菌液体培养基：每升由NaNO21.0 g、NaCO31.0 g、CaCO31.0 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL组成，pH为7.0～7.3。于121 ℃下灭菌20 min备用。

固体培养基：相应液体培养基中加入3%(质量分数)的琼脂粉。

固体斜面培养基：将相应的液体培养基装入20 mL试管中，每支试管装入1/3(体积分数)，再加入3%的琼脂粉。

1.3 硝化细菌的富集培养

称取两份40 g沉积物样品，在无菌操作台上分别接种于事先已灭菌、内装玻璃珠的200 mL亚硝酸细菌、硝酸细菌液体培养基的三角瓶中，置于水浴恒温振荡器内以26 ℃、160 r/min恒温振荡培养2 d。于无菌操作台上分别将培养液接种至新的亚硝酸细菌、硝酸细菌液体培养基，接种量为5%(体积分数)。重复此操作3次，共培养8 d，待用。

1.4 硝化细菌的分离纯化

取上述已富集的培养液分别划线至亚硝酸细菌、硝酸细菌固体培养基。用接种环挑取培养液在事先制好的平板上划线至划满整个平皿，再于30 ℃恒温生化培养箱中培养，3～4 d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，最后分离出长势较好的单菌落。

1.5 硝化细菌的菌种保存

用接种环分别将上述长势较好的10株亚硝酸细菌和硝酸细菌单菌落划线至亚硝酸细菌、硝酸细菌固体斜面培养基，于30 ℃下恒温生化培养箱中培养3 d后，放置4 ℃冰箱保存。

1.6 硝化细菌的鉴定

1.6.1 生理指标鉴定

亚硝酸细菌鉴定：取10株亚硝酸细菌单菌落接种于亚硝酸细菌液体培养基，另取一份亚硝酸细菌液体培养基接种无菌水作为对照。于26 ℃恒温振荡器中培养48 h。取培养液及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝酸存在则呈红色。实验结果表明，5～9号菌株培养液均呈现红色，而其他菌株及对照并没有显色。因此，5～9号菌株均有硝化活性，即为亚硝酸细菌。

硝酸细菌鉴定：取10株硝酸细菌单菌落接种于硝酸细菌液体培养基，另取一份硝酸细菌液体培养基接种无菌水作为对照。于26 ℃恒温振荡器中培养48 h。取培养液10 mL于试管中，加入醋酸5～8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO-转化为氮气逸出。分别取去除NO-后的培养液及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝酸已完全消失。再加二苯胺试剂2～4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。实验结果表明，均未出现蓝色，证明不存在将亚硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝酸细菌。

1.6.2 分子生物学鉴定

对所筛选细菌做16S rDNA做norB的基因扩增，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)设计：上游引物F(5’-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3’)和下游引物R(5’-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3’)。聚合酶链式反应(PCR)扩增体系：DNA聚合酶(Easy Taq DNA Polymeerase)1 μL(5 U)，10倍的内切酶缓冲液(Easy Taq Buffer)5 μL(200 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，200 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4)，2.5 mmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)4 μL，引物为1 μL(20 μmol/L)，模板DNA为1 μL，其余用双蒸水补足至50 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应后以1%(体积分数)的琼脂糖凝胶电泳检测[33-34]。

1.7 硝化细菌去除无机氮性能测试

养殖废水使用前先经121 ℃下灭菌20 min。将筛出的5株硝化细菌(5～9号)菌株于无菌台分别接种于500 mL养殖废水中。使用接种环向每瓶培养液接入3环菌株，另取一瓶养殖废水接种无菌水作为对照。将培养液置于120 r/min、30 ℃的恒温振荡器中。每次取样测定样品DO、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮，测定方法见文献[35]，取样时间为接种后6、12、24、36、48 h。养殖废水经菌种处理后排入集中处理工程。

2 结果与讨论

2.1 硝化菌株的分子生物学鉴定

将PCR产物送至深圳华大基因科技有限公司做测序，所测的序列长度在1 000 bp左右。将所得序列使用GenBank的BLAST程序进行比对，获得各序列的同源性信息，然后运用分子进化遗传分析软件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型计算各序列间的距离和序列相似性等，采用邻接法构建系统发育树，结果见图1。

由图1可知，5、6号菌与硝化杆菌(Nitrobacter)(NC_007406.1)具有最大同源相似性；7号菌与硝化菌(Nitrobactersp.)(NZ_CH672423.1、NZ_CH672418.1)具有最大同源相似性；8、9号菌与NitrobacterNC_007964.1具有最大的同源相似性。因此，结合1.6节，所筛选的5～9号细菌均为硝化细菌。

2.2 硝化细菌去除无机氮性能测试结果

2.2.1 氨 氮

氨氮过高对水产养殖有毒害，非离子氨进入水生生物体内后，对酶水解反应和膜稳定性产生明显影响，影响水生生物的生理生化指标与生长状况，进而影响水产养殖产量，因此要降低氨氮浓度。由图2可知，5号菌随着时间的延长对氨氮的去除率呈现先增大后减小的趋势，12 h时对氨氮达到最大去除率(42%)，之后对氨氮的去除率持续下降；6号菌在前36 h内对氨氮的去除率呈现缓慢增长趋势，36 h时达到最大去除率(27%)，36～48 h对氨氮去除率明显下降；7号菌在6 h时对氨氮去除率达到最大(48%)，之后呈缓慢降低的趋势，但其对氨氮均保持较高的去除率；8号菌随着时间的延长对氨氮去除率稳定在12%左右，表明8号菌对氨氮的去除效果具有持续稳定性；9号菌对氨氮去除率呈先降低后升高的趋势，6 h时去除率最大(36%)，24 h时去除率最小(18%)，36～48 h又恢复到较高的去除率。总体上，7、9号菌对氨氮去除效果具有稳定高效的去除效果，且7号菌对氨氮的去除效果优于9号菌；5、6号菌对氨氮去除作用时间较长，不利于氨氮的快速去除；8号菌对氨氮去除效果持续稳定，但其去除率较低，不利于氨氮的高效去除。不同菌株对氨氮去除效果存在较大差异可能与其本身对氨氮的耐受性、自身新陈代谢营养需求及其他环境因素(如DO、pH的变化)的差异而造成。刘少敏等[36]以聚乙烯醇-海藻酸钠作为包埋载体固定硝化细菌，制备固定小球，对生活污水中的氨氮去除效果进行研究，结果表明，在最佳条件状态下对生活污水中氨氮去除率超过90%。本实验采用的原位添加细菌处理养殖废水的方法达到48%的去除效果，表明所筛选硝化细菌具有良好的氨氮去除效果。

图1 根据序列和BLAST建立的系统发育树Fig.1 Phylogenetic trees of bacterial based on the results of BLAST of sequences

图2 不同硝化菌株处理下废水氨氮变化情况Fig.2 The changes of ammonia content of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.2 总 氮

水产养殖中总氮升高，会影响水体C/N，造成水质恶化，并影响水产养殖产量。由图3可知，对总氮的整体去除效果为7号菌>9号菌>8号菌>5号菌>6号菌。7号菌株在6 h对总氮达到一个较大的去除率(17%)，且随着时间的推移，7号菌对总氮去除效果持续高效稳定在17%左右。由此可知，所筛选出的5株硝化细菌对总氮的去除均具有一定的作用，而总氮的去除与反硝化作用有关，水产养殖一步步消耗水体中的DO，使得水体呈现缺氧状态，通过反硝化作用，将硝酸盐氮转化为氮气从水体中逸出，总氮得以在反硝化作用下去除。苏俊峰等[37]从生物陶粒反应器中筛选出6株异养硝化细菌，将异养硝化细菌扩大培养后，建立序批式活性污泥法(SBR)反应器并进行了总氮去除的研究，结果表明，其对总氮的最大去除率为47.27%。本研究中总氮去除率低于该值，这与SBR间歇运行方式有关，故其总氮去除率相对较高。

图3 不同硝化菌株处理下废水总氮变化情况Fig.3 The changes of total nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.3 硝酸盐氮

由图4可知，6、12 h，硝酸盐氮呈现增加趋势。这与硝化细菌将氨氮转化为硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有关，相应的氨氮含量降低。24～48 h，随着大部分的氨氮已初步转化，硝化细菌开始其对硝酸盐氮的降解产生作用，不同菌株对硝酸盐氮的去除效果总体为7号菌>8号菌>5号菌>6号菌>9号菌，36 h时7号菌株对硝酸盐氮的去除率达到最大(18%)。由此可知，所筛选出的硝化菌株对硝酸盐氮均具有一定的去除效果，且其作用时间均存在相对延滞。张峰峰等[38]研究表明，硝酸盐氮的去除主要是反硝化细菌起作用。本实验中大部分的氨氮初步转化完全后，硝化细菌开始以硝酸盐氮为氮源，硝酸盐氮含量减少。

图4 不同硝化菌株处理下废水硝酸盐氮变化情况Fig.4 The changes of nitrate nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.4 亚硝酸盐氮

水体中亚硝酸盐浓度过高，易造成水生生物亚硝酸盐中毒，也是对水产养殖危害较大的无机氮污染[39]。由图5可知，不同硝化菌株对亚硝酸盐氮的去除效果总体为7号菌>9号菌>5号菌>6号菌>8号菌；7号菌在取样的前3个时间段均对亚硝酸盐氮的去除保持一个较高稳定的去除率，6 h时达到最大去除率(13%)。随着时间推移，氨氮被硝化细菌氧化成硝酸盐氮和亚硝酸盐氮，使得硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量呈现增加状态，从而使得亚硝酸盐氮在48 h时去除相对不明显。部分的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮在缺氧状态下随着反硝化作用生成氮气得以去除，亚硝酸盐氮维持在一个相对平衡的缓慢减少的状态，这对于水产养殖是十分有利的。何腾霞等[40]研究表明，亚硝酸盐氮的去除与反硝化细菌有关，其筛选出的耐冷反硝化细菌对亚硝酸盐具有高效的去除效果。

图5 不同硝化菌株处理下废水硝酸盐氮变化情况Fig.5 The changes of nitrite nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

3 结 论

5株硝化细菌对养殖废水中氨氮、总氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有去除作用，对硝酸盐氮的去除存在相对延滞。其中，7号菌株去除效果最好，6 h时对氨氮、总氮、亚硝酸盐氮的去除率分别为48%、17%和13%；36 h对硝酸盐氮的去除率达18%。

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Researchonscreeningofnitrifyingbacteriafrommariculturewastewatersedimentsandbioremediationinorganicnitrogen

LIUYanyan1，XUZhencheng1，ZENGDong1，CHENJunfeng2，HUYanfang1，ZHANGWeili1，HULiqiong1.

(1.SouthChinaInstituteofEnvironmentalScience，MEP，GuangzhouGuangdong510655；2.SchoolofEnvironmentandEnergy，SouthChinaUniversityofTechnology，GuangzhouGuangdong510006)

2016-05-03)

刘彦彦，女，1989年生，硕士，主要从事水污染控制与给水净化方面的工作。#

。

*国家水体污染控制与治理科技重大专项(No.2012ZX07206)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.002