细菌对城市污水中斜生栅藻生长与产脂的影响

韩松芳,金文标,涂仁杰,周 旭,陈洪一



细菌对城市污水中斜生栅藻生长与产脂的影响

韩松芳,金文标*,涂仁杰,周 旭,陈洪一

(哈尔滨工业大学深圳研究生院,深圳微藻生物能源工程实验室,广东深圳 518055)

研究并分析了EM菌和LAS菌对斜生栅藻()生长和油脂积累的促进作用.结果表明:添加上述2种细菌对城市污水中斜生栅藻的干重和油脂产量有显著的促进作用,其油脂产量分别提高了36.2%和21.5%.通过对生成的脂肪酸甲酯进行气相色谱分析,结果显示EM菌的添加提升了斜生栅藻单不饱和脂肪酸的含量,有利于提升所得生物柴油的质量.培养结束后污水的菌群结构分析显示投加细菌会增加污水中菌群的丰富度和多样性,且相比于对照组,加菌后的试验组中-、-丰度有所提高,而拟杆菌门()丰度有所降低.

斜生栅藻；城市污水；细菌；产脂

随着能源危机与环境污染的加剧,微藻生物柴油越来越受到各国研究者的关注[1-3].微藻培养是其中一个重要环节,在微藻培养过程中,利用淡水培养微藻需消耗大量淡水资源,有悖于当前淡水资源紧缺的背景.同时,营养物质的投加进一步提高了微藻的培养成本[4-6].利用城市污水培养微藻可为微藻的生长提供丰富的氮磷等营养物质,有利于污水的资源化利用.

城市污水中含有大量的细菌,微藻与细菌之间存在互生、拮抗等复杂的相互关系[7].目前,关于菌藻的研究多集中在利用菌藻改善污水水质方面[8],如王冰等[9]研究表明小球藻和光合细菌共培养对污水中氨氮有较好的去除效果,氨氮去除率在4h内可达到80%.此外关于菌藻的研究多集中在利用细菌促进微藻在人工培养基中的生长与产脂方面.如Gonzalez等[10]构建了巴西固氮螺菌－普通小球藻共生系统,有效促进了藻细胞重量的大幅增加;Mayali等[11]发现甲藻()藻株NOAA1 共栖细菌群落中的某种细菌与一种杀藻的细菌41-DBG2竞争营养物质并占有优势,因而间接地保护了微藻免受杀藻细菌的攻击,从而促进了微藻的生长.但目前的研究中,将菌藻共生系统同时应用于实际城市污水处理与微藻培养制备生物柴油的研究报道较少,也极少关注微藻培养后菌群结构的变化情况[12-13].

斜生栅藻是一种具有高产脂效率的微藻[14].鉴于城市污水含有大量的原生菌类,且微藻与细菌之间存在着互生、拮抗等复杂的相互关系.本研究将基于城市污水系统中菌藻共生体系,筛选出能够有效促进斜生栅藻生长和油脂积累的细菌,并对微藻培养后城市污水中菌群结构进行分析,以期为微藻培养与污水资源化利用耦合技术的推广应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验藻种、菌种及培养

试验所用藻种斜生栅藻()购买于中国科学院(武汉)水生生物研究所淡水藻种库,藻种采用BG11培养基[15]进行传代培养保藏.所选取的细菌共有两个来源:水产养殖领域常用的对水质具有净化作用的光合细菌(广东省菌种保藏中心)、EM菌和枯草芽孢杆菌(河南中广集团天义生物谷);课题组前期从污水中筛选的高效氨化菌[16]、聚磷菌、阴离子洗涤剂降解菌(LAS菌)[17]、二甲基甲酰胺降解菌(DMF菌)[18].

试验所用城市污水取自深圳大学城市政污水井,经潜污泵抽取除去粗大悬浮物后使用,污水水质COD、TP、TN、NH4+-N分别为 140~200, 5.0~6.5,20~45,20~40mg/L.初步筛选对斜生栅藻产脂有促进作用的菌种时,将不同种类菌液分别投加于城市污水中,使投加后扣除基质吸光度值细菌悬液的吸光度值为600=0.02.进一步优化菌液投加量时,使投加菌液后扣除基质吸光度值细菌悬液的吸光度值600为 0、0.002、0.02、0.04、0.06.以BG11培养基培养处于对数生长期的斜生栅藻为种子液,等量分别接种于各试验组中,使接种后培养体积为600mL,以相应的未加斜生栅藻,投加菌剂的城市污水为空白对照,使扣除空白后藻液初始吸光度为680=0.1.于气泡柱式光生物反应器(直径为5cm、长度50cm、容积大小约为1L)培养,以仅接种斜生栅藻,未投加细菌组作为试验对照组,于培养温度(25±1)℃,光照强度100mmol/(m2·s),光暗比(L:D)为12:12h条件下,连续通气培养(空气流速为120mL/min,由底部通入).取培养达到稳定期的藻液测定扣除空白后藻细胞的干重、油脂产量.每组试验设3个平行对照.

1.2 微藻干重的测定

微藻的干重采用重量法测定,10mL藻液经预称重(1)的微孔滤膜(0.45µm)过滤、洗涤,于105℃下烘至恒重(2),不加微藻的空白对照组过滤烘干前后的质量差为0,微藻干重DW(g/L)的计算公式如下:

DW=(2-1-0)/ 0.01 (1)

1.3 微藻油脂产量与脂肪酸组成的测定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶剂提取法[19].待提取结束后,收集氯仿相,转移至预称重的锡纸盘中,待有机溶剂挥发完全后,于80℃烘箱中烘至恒重,得到微藻油脂产量,微藻细胞油脂含量为微藻油脂产量与微藻干重的百分比.

微藻脂肪酸分析,首先对提取的油脂进行甲酯化[20],将5mL藻液中脂肪酸转化成相对应的脂肪酸甲酯.采用赛里安456-GC气相色谱仪进行分析,色谱柱为BR-2560柱,100m´0.25mm(内径)´0.20µm(膜厚),FID检测器,分流方式进样,分流比为30:1,进样量为1µL.

1.4 菌群结构分析方法

微生物菌群结构的研究主要是通过对细菌16S rRNA的V4V5高可变区基因进行测序,并基于测序结果进行数据筛选以及微生物菌群信息的分析.主要包括:细菌组DNA提取、PCR扩增、电泳验证、PCR产物纯化与浓度测定、高通量测序以及测序结果分析.

1.5 数据分析方法

数据采用统计软件SPSS21.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法进行统计检验(<0.05).

2 结果与讨论

2.1 细菌促进斜生栅藻产脂的初步优化

菌藻间存在着共生、拮抗等复杂的相互关系,不同细菌对斜生栅藻干重与产脂的影响如图1所示.从图1中可以看出,所投加的细菌,其中大多数对斜生栅藻干重影响不大,说明了斜生栅藻对环境良好的适应性.其中投加EM菌的情况下斜生栅藻干重增加最为显著,相比未投加细菌的试验对照组(WW)提高了16.8%(<0.05).微藻的脂肪产量由微藻干重和微藻油脂含量共同决定,总体表现为EM菌、LAS菌对斜生栅藻的油脂产量增长有促进作用(<0.05),油脂产量相比于试验对照组提高了36.9%、19.6%,其他细菌对斜生栅藻的油脂产量无显著影响.故选取EM菌、LAS菌作为后续进一步优化的对象.

图1 斜生栅藻在投加不同细菌城市污水中的产脂情况

2.2 细菌促进斜生栅藻产脂的进一步优化

图2 斜生栅藻在添加不同量细菌城市污水中油脂产量

2.2.1 菌种最佳浓度的确定 细菌可以分解有机物为微藻生长提供所需碳源,但细菌与微藻间亦存在着空间与营养物质的竞争,因此对EM菌、LAS菌在城市污水中的投加量进行进一步优化,以寻求最佳的细菌投加量.从图2中可以看出,EM菌与LAS菌600值均为0.02时,对斜生栅藻的产脂促进作用最大,斜生栅藻油脂产量分别可达0.17 和0.15g/L,相较于试验对照组显著提高了36.2%和21.5%(<0.05).因此选取初始吸光度600为0.02的EM菌和LAS菌作为后续研究对象.

表1 添加细菌组与对照组脂肪酸分析

2.2.2 细菌对斜生栅藻脂肪酸甲酯的影响 投加EM菌、LAS菌与空白对照组的斜生栅藻脂肪酸组成如表1所示.由表1可知,各试验组斜生栅藻脂肪酸组成均以C16、C18为主,为绿藻中常见脂肪酸[21-22].Song等[23]和Ma等[24]的研究表明,适合制备生物柴油的原料应含有较多的C16~C18脂肪酸,主要包括十六烷酸(C16:0)、十八烷酸(C18:0)、十八烯酸(C18:1)、十八碳二烯酸(C18:2)、十八碳三烯酸(C18:3).对照组与投加EM菌、LAS菌的试验组中该5种脂肪酸在总脂肪酸中的含量占比分别可达94.65%、94.49%、95.46%,适宜于作为制备生物柴油的原料.同时,脂肪酸甲酯的结构会对生物柴油的性能(十六烷值、低温流动性、氧化安定性等)产生影响.研究表明,生物柴油的十六烷值随着饱和脂肪酸甲酯含量的增加而增加,多不饱和脂肪酸甲酯含量的增加而降低[25].生物柴油低温流动性随着饱和脂肪酸甲酯尤其是长碳链质量分数增高而变差.生物柴油的氧化安定性随着不饱和脂肪酸不饱和度增高而变差.高品位的生物柴油应尽量少的含有多不饱和脂肪酸甲酯和饱和脂肪酸甲酯,尽量多的含有单不饱和脂肪酸,以改善其十六烷值、低温流动性、氧化安定性、运动粘度等性能[26].从表1中可以看出,投加LAS菌后,各成分含量变化不大,但投加EM菌的试验组中单不饱和脂肪酸的含量相比于对照组提高了251%,有利于提升所得生物柴油的质量.

2.3 细菌对菌群结构影响

取培养达到稳定期的试验对照组与投加细菌(EM菌、LAS菌)的试验组藻液,通过DNA提取、16S V4V5高变区PCR扩增,高通量测序考察藻液中菌群的组成与多样性.

2.3.1 菌群多样性分析 菌群多样性是指某个集合群落内,不同类型微生物的变化以及它们之间的相对丰度.一般而言,系统中微生物菌群多样性越高,越有利于抵抗外界环境的变化,较快的进行系统自我调整和更新.

表2 不同样品的生物多样性

Alpha多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目,因此也被称为生境内的多样性.多样性指数是反映丰富度和均匀度的综合指标,与以下两个因素有关:(1)种类数目,即丰富度;(2)种类中个体分配上的均匀性.群落丰富度指数,包括Chao1指数和observed species指数,数值越大,说明样品中物种越丰富;群落多样性的指数,包括PD whole tree指数、Shannon指数和 Simpson指数,数值越大,说明样品群落多样性越高.所得试验组与对照组样品的Alpha多样性参数统计结果如表2所示.从表2可以看出,投加EM菌、LAS菌的试验组各项指数均大于对照组,表明投加细菌会提高斜生栅藻藻液中菌群的丰富度和多样性,有利于系统稳定.

2.3.2 主导菌群分析 对投加EM菌、LAS菌的试验组与试验对照组有效序列在不同物种分类水平上的丰度进行分析.图3(a)为样品在门分类级别上的丰度.从图中可以看出,对照组与试验组在门级别上,均以变形菌门()占主导.这与世界各地分布的污水处理厂中微生物菌群结构的相关报道一致[27].对污水中有机物具有较好降解作用,试验对照组与投加EM菌、LAS菌组,丰度分别高达62.3%、73.8%和87.2%,可为斜生栅藻生长提供所需二氧化碳.其他占主导的门为拟杆菌门()丰度分别为33.1%、24.4%和10.6%.有研究表明拟杆菌门是太湖中占主导的藻际微生物之一,除了可以降解复杂有机大分子外,还可裂解微囊藻细胞与蓝藻细胞[28],加菌处理组相比于试验对照组斜生栅藻生物量增加,拟杆菌门丰度降低,可能与拟杆菌门对微藻的裂解作用有关.图3(b)为样品在纲分类级别上的丰度,由于门的丰度高达62.3%~87.2%,且处理组比对照组有大幅度提高,因而分析了其下属的-、-、-、-、-的丰度.结果表明,试验对照组-的丰度最大,为39.4%,其它依次为β-、-,丰度分别为12.9%、9.8%.而投加EM菌与LAS菌组,-的丰度(分别为32.1%、28.8%)均有所降低,-的丰度(分别为28.6%、31.4%)与-的丰度(分别为12.9%、26.9%)相较于对照组均有较大幅度增高.研究表明-、-均为水华期间占主导的藻际微生物[28],尤其是-是典型的植物(包括微藻)生长促进细菌[29].此外,,对微藻絮凝有关键作用[30],加菌处理组的降低,可一定程度减少斜生栅藻的絮凝沉降,更有利于斜生栅藻与环境中营养物质的充分接触,从而有利于其生长.

(a)

(b)

图3 样品在不同层级上的丰度

Fig.3 The relative abundances of the samples

3 结论

3.1 城市污水中EM菌初始吸光度600为0.02, LAS菌初始吸光度600为0.02时,对斜生栅藻的干重和油脂产量促进作用最显著,油脂产量分别可达0.17和0.15g/L,比试验对照组提高了36.2%和21.5%.通过对生成的脂肪酸甲酯进行气相色谱分析,结果显示EM菌的添加可提升斜生栅藻单不饱和脂肪酸的含量,有利于提升所得生物柴油的质量.

3.2 培养结束后污水的菌群结构分析显示投加细菌会增加污水中菌群的丰富度和多样性,且加菌后的试验组中丰度有所降低,-、-丰度增加.

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Effects of bacteria on growth and lipid production ofcultivated in municipal wastewater.

HAN Song-fang, JIN Wen-biao*, TU Ren-jie, ZHOU Xu, CHEN Hong-yi

(Shenzhen Engineering Laboratory of Microalgal Bioenergy, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)., 2017,37(10)：3867~3872

In the study, EM bacteria and LAS bacteria were found to enhance the growth and lipid production ofcultivated in municipal wastewater. The results showed that the lipid production ofwas increased by 36.2% and 21.5% after adding the above-mentioned bacteria, respectively. According to the GC analysis of the lipids, EM bacteria could increase the content of monounsaturated fatty acid in, and thus improving the grade of biodiesel. The analysis of microbial community structure in municipal wastewater showed that the richness and diversity of bacteria in wastewater were increased significantly. In addition, the abundances of-、-were increased, while the abundance ofwas decreased.

；municipal wastewater；bacteria；lipid production

X172

A

1000-6923(2017)10-3867-06

韩松芳(1989-),女,河南周口人,哈尔滨工业大学深圳研究生院博士研究生,主要从事微藻生物质能源与污水资源化研究.

2017-03-22

深圳市科技计划资助项目(JCYJ20150529114024234)

* 责任作者, 教授, jinwb@hit.edu.cn