蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

温中华，李建民，陈薇

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

温中华，李建民，陈薇

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

目的：构建蜱传脑炎病毒（TBEV）结构蛋白E的原核表达载体，表达重组蛋白。方法：PCR扩增E蛋白全长基因片段，插入原核表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达，镍柱纯化、复性。结果：E蛋白在大肠杆菌中获得表达，表达量达60 mg/L；重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应；用重组E抗原免疫家兔后，能检测到较高的抗体水平。结论：原核表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性，可用于制备ELISA诊断试剂。

蜱传脑炎病毒；E蛋白；原核表达

蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）在分类学上属黄病毒科（Flavivirade）黄病毒属（Flavivirus），有3个亚型，即欧洲亚型、西伯利亚亚型和远东亚型[1-2]，能够引起人体急性中枢神经系统传染病——蜱传脑炎。世界卫生组织统计该病每年发病10 000～12 000例，在我国多发于东北、西南及西北林区[3]，已被列为5大职业性传染病之一。TBEV为单正链RNA包膜病毒，包含3个结构蛋白，即衣壳蛋白C、前膜蛋白M（prM）、包膜蛋白E，以及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[4]，其中结构蛋白E是病毒的主要抗原成分，能刺激机体产生中和抗体，决定着病毒的细胞嗜性与毒力。制备并纯化E抗原蛋白，既可作为TBE的诊断制剂，又可作为新的免疫原蛋白，亦可用于中和抗体的筛选和中和表位的鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌感受态细胞Top10、BL21购自天根生化有限公司；质粒pET-32a为本实验室留存；TBEV结构蛋白E基因（含结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）由博迈德公司合成；引物由Invitrogen公司合成；Ex Taq酶、核酸及蛋白marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、pMD18-T载体购自NEB公司；凝胶回收、质粒提取试剂盒购自Omega公司；HisTrap镍柱购自GE公司；HRP羊抗兔及羊抗人IgG二抗购自Sigma公司；化学发光显色液购自Millipore公司。

1.2 原核表达质粒构建

利用上游引物（5'-CATATGTCGCGTTGCACA CACTTGGAAAAC-3'）和下游引物（5'-GCGGCCG CCGCCCCCACTCCAAGGGTCATGGCCAAG-3'）（分别引入NdeⅠ和NotⅠ酶切位点）扩增E基因，回收PCR扩增产物，连T载体，转化感受态Top10细胞，挑单克隆培养过夜，PCR鉴定阳性克隆。将鉴定正确的基因与pET-32a质粒用NdeⅠ和NotⅠ双酶切、连接并转化感受态Top10细胞，挑单克隆培养过夜，PCR鉴定阳性克隆，抽提阳性克隆质粒进行双酶切鉴定并测序。

1.3 重组蛋白诱导表达

将鉴定正确的阳性克隆质粒转化BL21细胞，经氨苄西林选择培养后，挑单克隆到5mL含100μg/mL氨苄西林的 LB培养基，37℃、220r/min振荡培养，D600nm值达0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达4h，诱导结束后，3000r/min离心10min收取菌体沉淀，加入1mL PBS重悬后超声波裂解10min，12 000r/min离心10min，分别取超声波后的全菌液、上清、沉淀（用等体积PBS重悬），加入4×SDS上样缓冲液，100℃加热5min，SDS-PAGE分析表达结果。

1.4 重组蛋白大量表达及纯化

将阳性克隆菌株接种到100mL含氨苄西林的LB培养基，37℃、220r/min振摇过夜，将其全部接种到1 L含氨苄西林的LB培养基中继续培养，当 D600nm值达 0.6～0.8时，加入1mmol/L IPTG诱导4h，8000r/min离心10min收菌体；用100mL缓 冲 液 A（含 50mmol/LTris，0.5mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl及5％甘油）重悬菌体，超声波破碎30min，4℃、12 000r/min离心20min，弃上清；PBS洗涤沉淀2次；在沉淀中加入100mL缓冲液 A、100μL DTT（0.5 mol/L）及 1.5mL 十二烷基肌氨酸钠（20％）重悬，4℃静置过夜；4℃、12 000r/min离心20min，取上清，加入1050μL PEG4000（浓度 0.2％）、2100μL氧化型谷胱甘肽（50mmol/L）和还原型谷胱甘肽（100mmol/L），室温静置2h；用TE缓冲液（含10mmol/L Tris-HCl和 1mmol/L EDTA，pH8.0）透析 72h。将透析后的E蛋白用结合缓冲液（含10mmol/L磷酸二氢钠、300mmol/L NaCl、5mmol/L咪唑，pH7.4）稀释至1/10，上镍柱，用洗脱缓冲液（含10mmol/L 磷 酸 二 氢 钠 、300mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH7.4）进行线性梯度洗脱，收集峰用10mmol/L磷酸氢钠缓冲液（pH7.4）超滤换液，Bradford法测蛋白浓度。取10μg加入SDS上样缓冲液，加β巯基乙醇，100℃加热5min，SDSPAGE分析结果。

1.5 Western印迹

取10μg纯化的E蛋白进行 SDS-PAGE，转PVDF膜，用5％脱脂牛奶封闭过夜；加入商品化疫苗免疫过的志愿者阳性血清（用封闭液1∶50稀释），室温孵育 1h；TBST洗涤4次，7min/次；加入HRP羊抗人二抗，室温孵育1h；TBST洗涤4次，7min/次；淋加显色液，观察结果。

1.6 ELISA实验

取2μg/mL的E蛋白包被酶标板，4℃包被过夜，PBST洗涤3次，5min/次；用5％脱脂牛奶于37℃封闭1h；洗涤，加入一抗（人和猴抗TBEV多抗，浓度 10μg/mL），37℃孵育 1h；洗涤，加入HRP羊抗人二抗（1∶1000），37℃孵育1h；洗涤，加显色液，37℃显色15min，加终止液终止反应，测定D450nm值。同时，用Abcam公司商品化TBEV ELISA试剂盒进行检测，比较结果。

1.7 兔多克隆抗体制备及检测

将纯化的E抗原蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合后免疫新西兰大白兔（免疫前取血清），采用背部皮下注射免疫，每7d免疫1次，共计3次，剂量1 mg/（次·只）。第28d天耳缘静脉取血，分离血清，用间接ELISA法检测血清抗体效价。

2 结果

2.1 质粒构建及鉴定

TBEV结构蛋白E基因PCR扩增后，获得约1500bp的片段（图1）；构建的pET-32a/E质粒经NdeⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，得到目的条带（图2），基因测序与原序列一致，无碱基突变。

2.2 E蛋白诱导表达及纯化

将表达质粒pET-32a/E转化BL21细胞诱导表达，菌体超声波破碎后进行SDS-PAGE鉴定，结果在全菌液和沉淀中均出现目的蛋白大小条带（相对分子质量约55 000），而上清中则无（图3），说明E抗原蛋白以包涵体形式表达。包涵体经十二烷基肌氨酸钠变性，在含氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的氧化还原体系中透析复性，用Ni柱纯化获得纯度较高的蛋白（图4）；测定浓度后计算，1 L菌液诱导后能获得约60 mg蛋白。

2.3 Western印迹

图1 TBEV E基因的PCR扩增

图2 pET-32a/E重组质粒的双酶切鉴定

用人TBEV阳性血清对纯化的E抗原蛋白进行Western印迹检测，在相对分子质量约55 000处出现惟一目的条带（图5）。

2.4 ELISA结果

用纯化的E抗原包被酶联板，对商品化疫苗免疫后的人和猴的阳性、阴性血清纯化多抗进行ELISA检测，结果表明我们纯化的E抗原蛋白能与阳性多抗发生特异性反应（图6）。同时，我们将三免第7d的兔血清1∶300稀释后与E抗原进行间接ELISA反应，结果如图6，说明E蛋白具有免疫原性。

图3 TBEV E蛋白原核诱导表达的SDS-PAGE

图4 TBEV E蛋白的Ni柱纯化

图5 TBEV E蛋白的Western印迹

图6 重组E抗原蛋白的ELISA检测

3 讨论

目前商品化的蜱传脑炎ELISA诊断试剂大多用的是灭活TBEV，昂贵且存在一定的安全隐患，同时与其他黄病毒属病毒还有交叉结合[5]。E抗原蛋白是TBEV的主要抗原成分，决定着病毒的细胞嗜性与毒力，利用重组E蛋白作为诊断抗原是一种经济安全的选择。

王丹[6]、朱晓磊[7]等原核表达了E蛋白结构域Ⅲ，并以之作为TBEV特异性诊断抗原。与之相比，我们表达的E抗原全蛋白分子覆盖了全部抗原表位，在作为诊断试剂时可能会有更高的检测准确率，但这还需要进一步的血清学验证。邵宾等[8]亦通过原核表达了蜱传脑炎病毒E蛋白，但获得的包涵体未能复性，可能影响其蛋白活性。在本研究中，我们利用pET-32a载体在原核细胞中表达了TBEV抗原E蛋白，该蛋白以包涵体的形式存在。我们首先试图用尿素作为变性剂，将包涵体变性后通过减少尿素浓度逐步透析复性，结果发现在复性过程中E蛋白总是会析出。于是又使用了比较温和的变性剂十二烷基肌氨酸钠，并在复性过程中加入氧化还原体系（还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽），最终得到了复性后的E抗原蛋白。

综上所述，本研究获得了重组E抗原蛋白，该蛋白既可作为TBEV特异性诊断抗原之一，又可作为新的TBEV疫苗成分，亦可用于中和抗体的筛选和中和表位的鉴定。

[1] Ecker M,Allison S L,Meixner T,et al.Sequence analysis and genetic classification of tick-borne en⁃cephalitis viruses from Europe and Asia[J].J Gen Vi⁃rol,1999,80（1）:179-185.

[2] Gould E A,De Lamballerie X,Zanotto P M,et al.Evolution,epidemiology,and dispersal of flaviviruses re⁃vealed by molecularphylogenies[J].AdvVirusRes,2001,57:71-103.

[3] 杨蓝萍,张天寿,袁晓平,等.从云南蝙蝠及牛蜱中分离出两株森林脑炎病毒[J].中国人兽共患病学杂志,1993,1:22-23.

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[5] Niedrig M,Vaisviliene D,Teichmann A,et al.Compar⁃ison of six different commercial IgG-ELISA kits for the detection ofTBEV-antibodies[J].JClin Virol,2001,20:79-182.

[6] 王丹,康晓平,郝淮杰,等.蜱传脑炎病毒TBE-E-D3抗原的原核表达纯化及ELISA方法鉴定[J].生物技术通讯,2011,22（5）:636-639.

[7] 朱晓磊,林方,康晓平,等.森林脑炎病毒E基因Do⁃mainⅢ段的克隆表达及鉴定[J].吉林农业大学学报,2012,34（6）:667-671.

[8] 邵宾,陈斌,谢菲,等.蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达[J].河北农业大学学报,2010,33（3）:87-91.

Expression and Identification of Recombinant Tick-Borne Encephalitis Virus Envelope Protein in Escherichia coli

WEN Zhong-Hua,LI Jian-Min,CHEN Wei*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:cw0226@foxmail.com

Objective:To construct prokaryotic expression vectors for tick-borne encephalitis virus（TBEV） enve⁃lope（E） protein,and express recombinant TBEV E protein in Escherichia coli.Methods:The coding sequence of full length E protein was amplified by PCR and cloned into the pET-32a vector.The protein of interest was ex⁃pressed in E.coli with IPTG induction and purified by Ni-NATB bead.Results:We obtained recombinant E pro⁃tein in E.coli with the yields of ～60 mg/L,and it was identified by specific human anti-TBEV polyclonal antibod⁃ies.After being immunized with E antigen in rabbits,specific high-level antibodies could be detected in serum.Conclusion:The prokaryotically expressed recombinant E protein with the antibody binding activity can be devel⁃oped as a ELISA diagnostic reagents.

tick-borne encephalitis virus;envelope protein;prokaryotic expression

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0495-04

2017-02-13

“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09304103）

温中华（1989- ），男，硕士研究生，（E-mail）zhonghuawen2014@163.com

陈薇，（E-mail）cw0226@foxmail.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.017