CIP2A在鼻咽癌中的表达及其与鼻咽癌临床病理特征的关系研究

胡信 潘君芬 吴国民

CIP2A在鼻咽癌中的表达及其与鼻咽癌临床病理特征的关系研究

胡信 潘君芬 吴国民

目的分析蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）在鼻咽癌组织中的表达情况，并探讨其与鼻咽癌临床病理特征的关系。方法 选取鼻咽癌病理标本70例，另择正常鼻咽部组织30例作为对照。采用免疫组化法检测CIP2A蛋白表达情况，采用RT-PCR法检测CIP2A mRNA表达情况。观察并比较CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达情况；分析CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系。结果 鼻咽癌组织中CIP2A蛋白、mRNA阳性表达率均高于鼻咽部正常组织（65.71%vs 26.67%、81.43%vs 16.67%，均P＜0.05）。CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌患者性别、年龄、病理类型无关（均P＞0.05），而与表示肿瘤范围的T分期、淋巴结有无转移的N分期及综合的临床分期有关（均P＜0.05）。结论 CIP2A与鼻咽癌的发生和浸润转移有关，可作为判断鼻咽癌恶性程度的一个重要生物学指标。

鼻咽癌 CIP2A 免疫组化 RT-PCR

鼻咽癌是我国，尤其是长江以南地区的一种高发恶性肿瘤，其发病率居于耳鼻咽喉科恶性肿瘤首位。鼻咽癌的发病机制目前尚未明确，以往的研究表明其发生是EB病毒感染、遗传易感性、环境致癌物等多种因素共同作用的结果。蛋白磷酸酶2A（PP2A）的癌性抑制因子（CIP2A）是一种内源性蛋白，可通过与癌转录因子c-Myc直接结合，在分子水平对PP2A起到抑制作用，进一步抑制c-Myc蛋白水解，可能在促进细胞增殖和恶性转化、维持细胞的恶性表型方面起重要作用[1]。研究表明，CIP2A在许多恶性肿瘤中高表达，如结肠癌[2]、胃癌[3]、非小细胞肺癌[4]、乳腺癌[5]等，但其在鼻咽癌中的表达情况报道少见。本研究采用RT-PCR、免疫组化法分析CIP2A在鼻咽癌组织中的表达情况，并探讨其与鼻咽癌临床病理特征的关系，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010年7月至2013年7月在本院门诊行鼻咽部活检，后确诊为鼻咽癌的70例患者的病理标本。所有患者术前均未进行放、化疗。其中男64例，女6例；年龄28～72岁，中位年龄57.5岁；未分化型鼻咽癌29例，低分化型鼻咽癌41例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期各35例。TNM分期T1期25例，T2期26例，T3期13例，T4期 6例；N1期 15例，N2期 22例，N3期 6例，N0期27例；无肿瘤远处转移的患者。所有标本均为活检时即刻获取的新鲜组织，组织标本在获取后立即一分为二，其中一份立即转移至-80℃低温冰箱中冷冻保存以供RT-PCR检测时使用，而准备用于免疫组化检测的另一份标本放入10%甲醛溶液中固定。另择因鼻咽部局部隆起而行鼻咽部活检、并病理证实为鼻咽部黏膜慢性炎的30例基本正常鼻咽部组织作为对照。

1.2 主要试剂及RT-PCR引物 CIP2A多克隆抗体（Santa Crus公司）；生物素标记的羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；S-P免疫组化试剂盒以及DAB溶液PBS（pH=7.4）（福州迈新生物科技有限公司）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640干粉（Gibco公司）；RNA Fast200总RNA极速提取试剂盒（上海飞捷生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒以及 2×Taq PCR Mastermix（TaKaRa公司）。根据人类CIP2A的cDNA序列，应用Primer软件设计 PCR引物，上游引物 5′-TACGAATTCATGCGACGGCTGCTGATC-3′，下游引物 5′-TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3′，扩增产物共307bp。以β-actin基因表达产物作内参照设计PCR引物，上游引物5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，扩增产物共197 bp，由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CIP2A蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。所有标本经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，用SP法进行免疫组化染色，CIP2A多克隆抗体浓度1∶200，实验步骤按试剂盒说明书进行，显微镜下观察，成像系统拍照并对阳性结果进行分析。PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为Santa Cruz公司提供的阳性片。由2位病理科医师读片，根据染色强度和阳性细胞百分比综合结果评估。染色强度评分：（1）阴性：与背景色一致，得 0 分；（2）弱阳性：淡黄色，得 1 分；（3）阳性：黄色，得2分；（4）强阳性：棕黄色，得3分。阳性细胞百分比评分：（1）＜10%，得 0分；（2）11%～25%，得 1分；（3）26%～50%，得 2分；（4）＞50%，得 3分。采用染色强度评分乘以阳性细胞百分比评分的积作判定：＜2分为阴性（-），2～4分为弱阳性（±），5～7分为阳性（+），＞7分为强阳性（++）；除去阴性结果的所有弱阳性、阳性及强阳性视为CIP2A蛋白阳性表达。

1.3.2 CIP2A mRNA表达检测 采用RT-PCR法进行基因扩增，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。鼻咽癌和正常鼻咽部组织中总RNA按Fast200总RNA极速提取试剂盒说明书步骤进行提取，溶于无RNase酶水中，-80℃保存备用。应用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒，取1μg总RNA，在10μl体系中以Oligo dT Primer为引物，应用PrimeScriptTMRT Enzyme Mix逆转录合成cDNA，合成过程按试剂盒说明书进行。按照2×Taq PCR Mastermix试剂说明配置PCR反应体系，合成所得PCR产物在4℃下保存，然后取PCR扩增产物5μl点样于20g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。应用Gene Snap软件系统分析扩增条带，未显示CIP2A基因扩增条带表示CIP2A mRNA阴性表达，显示CIP2A基因扩增条带表示CIP2A mRNA阳性表达；将CIP2A基因与β-actin基因扩增条带吸光度值的比值（CIP2A/β-actin）计为CIP2A mRNA的相对表达水平。

1.4 观察指标 观察并比较CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达情况；分析CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达情况比较 见图1。

图1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达情况（a：鼻咽癌组织；b：鼻咽部正常组织；SP法，×400）

由图1可见，CIP2A蛋白阳性染色定位于细胞质中，呈棕黄色细小颗粒，也可以呈弥漫分布。鼻咽癌组织中CIP2A蛋白阳性表达率为65.71%（46/70），而鼻咽部正常组织中CIP2A蛋白阳性表达率为26.67%（8/30），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达情况比较 见图2。

图2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常组织中的表达电泳图（C：鼻咽癌组织；N：正常鼻咽部组织）

由图2可见，鼻咽癌组织中CIP2A mRNA阳性表达率为81.43%（57/70），鼻咽部正常组织中CIP2A mRNA阳性表达率为16.67%（5/30），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。鼻咽癌组织中CIP2A mRNA的平均表达水平为0.57，鼻咽部正常组织CIP2A mRNA的平均表达水平为0.11，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。2.3 CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系 以70例鼻咽癌组织中CIP2A mRNA的平均表达水平（0.57）为界，将其分为高表达组（≥0.57，共46例）及低表达组（＜0.57，共24例）。CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系见表1。

由表1可见，CIP2A mRNA表达水平与鼻咽癌患者性别、年龄、病理类型无关（均P＞0.05），而与表示肿瘤范围的T分期、淋巴结有无转移的N分期及综合的临床分期有关（均P＜0.05）。

表1 CIP2AmRNA表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

CIP2A是一种能够抑制PP2A活性的蛋白，可以通过抑制PP2A对癌蛋白c-Mycr的脱磷酸化作用，稳定c-Myc蛋白二元磷酸化结构，减少c-Myc蛋白被泛素化水解；同时，作为核转录调节因子的c-Myc又能促进CIP2A mRNA的转录，从而形成一个正反馈环路[6]。研究发现，在良性组织中，除在骨髓、脑和前列腺等组织中CIP2A mRNA呈中高度表达外，其余组织中表达均较低或无表达[7]。但在许多恶性肿瘤中，如结肠癌[2]、胃癌[3]、非小细胞肺癌[4]以及乳腺癌[5]中CIP2A都高表达，且与肿瘤恶性程度，特别是与肿瘤的浸润、转移密切相关，影响患者预后。CIP2A在维持细胞表形转化，促进细胞增殖和体内肿瘤生长方面起关键作用[1]。CIP2A的过度表达可以促进细胞转化和增殖，阻止细胞衰老[7]。许多研究已经表明癌蛋白c-Myc在许多恶性肿瘤的癌性增生与发展阶段起重要作用，并且在癌变后仍持续呈现高表达状态，是恶性肿瘤浸润、复发及预后等生物学行为的影响因素[8-12]。而CIP2A通过抑制PP2A而促进c-Myc的表达，因此，推测CIP2A可能和肿瘤的浸润、复发及预后有关。

本研究应用免疫组化和RT-PCR的方法检测了CIP2A在鼻咽癌及正常鼻咽部组织中的表达情况。免疫组化结果显示，在65.71%的鼻咽癌组织中检测到CIP2A蛋白阳性表达，要明显高于正常鼻咽部组织中CIP2A蛋白阳性表达（26.67%），两者差异有统计学意义；同样，RT-PCR结果也显示CIP2A mRNA在鼻咽癌组织中的表达明高于正常鼻咽部组织，以上结果提示CIP2A可能与鼻咽癌的发生有关。进一步分析CIP2A的表达与鼻咽癌临床病理特征的关系发现，在肿瘤原发灶周边的浸润转移中，根据TNM分期中的T分期，级别越高的肿瘤组织中CIP2A表达要高于级别低的；有淋巴结转移的CIP2A的表达要明显高于无淋巴结转移的，而且N分期越高，CIP2A表达也越高；综合起来按临床分期比较，Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌组织CIP2A表达水平也显著高于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义；但在不同年龄段、不同性别以及不同病理类型中，CIP2A表达差异无统计学意义。这提示CIP2A可能与鼻咽癌的浸润、转移过程有关，是造成鼻咽癌预后不良的因素之一。但CIP2A在鼻咽癌发生、发展中的具体作用机制尚不明确，尚待进一步研究。

综上所述，CIP2A与鼻咽癌的发生和浸润转移有关，可作为判断鼻咽癌恶性程度的一个重要生物学指标，有望成为肿瘤综合治疗的作用靶点。

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Expression of CIP2A in nasopharyngeal carcinoma and its clinicopathological significance

HU Xin,PAN Junfen,WU Guomin.Department of Otorhinolaryngology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou 317000,China

ObjectiveTo investigate the expression of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)and its clinicopathological significance.Methods The expression of CIP2A protein and mRNA in 70 specimens of NPC and 30 specimens of normal nasopharyngeal tissue was detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The correlation between CIP2A expression and clinicopathological features of NPC was analyzed. Results The expression of CIP2A protein and mRNA was higher in NPC than that in normal nasopharyngeal tissue(65.71%vs 26.67%,81.43%vs 16.67%,respectively,both P＜0.05).The expression of CIP2A mRNA was correlated with tumor size,lymph node metastasis and clinic stages of NPC (all P＜0.05),not with the gender,age of the patients and pathological type(P＞0.05).Conclusion CIP2A may be associated with the occurrence,invasion and metastasis of NPC,suggesting that it can be used as an indicator for malignant degree ofnasopharyngealcarcinoma.

Nasopharyngealcarcinoma(NPC) Cancerous inhibitor ofprotein phosphatase 2A(CIP2A) Immunohistochemistry RT-PCR

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-1670

317000 浙江省台州医院耳鼻咽喉科（胡信、吴国民），病案统计室（潘君芬）

胡信，E-mail：hu0428@126.com

2017-07-13）

（本文编辑：李媚）