脂肪间充质干细胞复合人工真皮修复大鼠深度烧伤创面的研究

范友芬 乐欣 晋国营 虞耀华

●论 著

脂肪间充质干细胞复合人工真皮修复大鼠深度烧伤创面的研究

范友芬 乐欣 晋国营 虞耀华

目的探讨脂肪间充质干细胞（ADSCs）复合人工真皮（皮耐克）修复大鼠深度烧伤创面的作用。方法 用胶原酶法消化SPF级绿色荧光蛋白转基因大鼠腹股沟脂肪，获得ADSCs，用流式细胞仪分析鉴定其表面特异性标志物，并观察ADSCs向成骨细胞、成脂细胞分化的潜能。建立大鼠深度烧伤模型，将大鼠对称的左、右创面分为实验组和对照组。实验组采用人工真皮+ADSCs治疗，对照组采用人工真皮+0.9%氯化钠注射液治疗。分别于术后7、14、21d观察创面最大直径以评估创面愈合情况，术后21d时荧光显微镜下观察创面冷冻切片评估实验组与对照组创面情况。结果 成功获得大鼠ADSCs，具有较强的增殖能力及多向分化能力。ADSCs对间充质干细胞标志物CD29、CD90、CD44呈现高表达；对造血干细胞表面标志物CD34、白细胞共同抗原CD45则呈低表达。治疗后14d时，实验组创面最大直径明显小于对照组（P＜0.05），即实验组创面愈合速度比对照组明显增快。治疗后21d，实验组创面可见散在点状绿色荧光，而对照组未观察到明显荧光。结论 ADSCs联合人工真皮作用于深度烧伤创面可显著促进创面愈合，是一种有效的治疗深度烧伤的方法。

深度烧伤 人工真皮 脂肪间充质干细胞

大面积深度烧伤是一种极易导致患者死亡和创面修复后功能障碍的创伤，随着医疗水平的提高，此类患者的病死率已明显下降[1-2]，但创面修复仍是世界范围的难题[3]。主要原因是这类烧伤患者通常需要移植大量自体皮，而烧伤面积过大往往导致自体可用的供皮区极少[3]。近年来随着生物医学工程和分子生物学的迅猛发展，世界范围内已出现大量商品化、临床化、不同功能的人工皮肤替代品，但目前尚无一种特别有效的人工皮肤替代品能达到自体皮移植的成活率和效果。造成这一问题的主要原因是人工真皮缺乏细胞支持，自体细胞生长速度过慢导致血管生成周期长，胶原蛋白生成不足，无法形成毛囊和汗腺等皮肤附属结构[4]。

与此同时，近年来有学者针对各种间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）的深入研究已证明，MSC能显著加快慢性创面和放射性创面的愈合，并且在创面愈合的炎症期、增生期、重塑期3个阶段持续发挥调控作用[5-9]。脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）作为生物成体MSC的一种，广泛分布于各物种不同部位的脂肪组织中，数量巨大且取材方便，体外扩增和自我更新能力强，这使得同种异体之间的ADSCs移植变为可行，从而为深度烧伤的治疗提供一种新思路。基于此，本研究以大鼠作为研究对象，将ADSCs与人工真皮进行生物复合，以期解决人工真皮缺乏细胞支持这一问题，使其达到更好的修复效果，从而为烧伤创面皮肤再生提供新参考。

1 材料和方法

1.1 材料 实验级雌性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，成年SPF级雌性绿色荧光蛋白转基因大鼠3只，均购于宁波大学实验动物中心。人工真皮（商品名：皮耐克PELNAC），购于杭州瑞腾医疗器械有限公司；FBS高糖DMEM完全培养液、干细胞完全培养液、成脂诱导液A、成脂诱导液B、成骨诱导液，均购于美国Thermo Fisher Scientific公司；PBS、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、抗大鼠CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE 单 抗 、PE-IgG1、FITC-IgG1、茜素红染色剂、油红O染色剂等其他试剂，均购于大连TaKaRa公司；流式细胞分析仪购于美国贝克曼库尔特公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs的分离、培养 （1）ADSCs的分离：取绿色荧光蛋白转基因大鼠，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉满意后行腹部、双下肢消毒，无菌超净工作台内作腹部正中切口并向双侧腹股沟内侧分离取双侧脂肪组织并剥除血管组织，缝合切口；以无菌PBS冲洗取出的脂肪组织2次后，用PBS预配1%Ⅱ型胶原酶37℃振荡消化30min，沉淀5min后小心取中层液体过200目细胞筛后，按1∶3比例加入10%FBS高糖DMEM完全培养液终止反应，种于培养皿内。（2）ADSCs的培养：ADSCs分离后第2天PBS冲洗换液，10%FBS高糖DMEM完全培养液培养，隔天换液；待细胞生长100%后进行传代。

1.2.2 大鼠ADSCs的细胞流式表型鉴定 取第3代的ADSCs，用胰蛋白酶进行消化，将其制备成单细胞悬液。1×106/ml细胞分别加入抗大鼠 CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE 单抗各 1μl，PE-IgG1、FITCIgG1为阴性对照。4℃避光孵育30min，以流式细胞分析仪检测细胞表型。

1.2.3 大鼠ADSCs向成骨细胞、成脂细胞诱导分化及鉴定 （1）成骨细胞诱导及鉴定：待ADSCs达到80%～90%融合时，用胰蛋白酶消化后将其接种于六孔板中，每孔约3×103个细胞，按2ml/孔剂量加入干细胞完全培养液，放入温度37℃、5%二氧化碳孵箱中培养，24h后移去培养液，按2ml/孔剂量加入成骨诱导液；每3d换液1次，如此诱导2～3周；2～3周后，待钙结节形成，进行茜素红染色。倒置电子显微镜下观察并记录。（2）成脂细胞诱导及鉴定：待ADSCs达到80%～90%融合时，用胰蛋白酶消化后将其接种于六孔板中，每孔约2×104个细胞，按2ml/孔剂量加入干细胞完全培养液，放入温度37°C、5%二氧化碳孵箱中培养、每3d更换干细胞完全培养液，直至细胞达到100%融合。随后移去培养液，按2ml／孔剂量加入成脂诱导液A开始诱导，3d后更换为成脂诱导液B维持，24h后再次更换为成脂诱导液A诱导，如此循环3次；当细胞内脂滴数量增多，但体积相对较小时，可用成脂诱导液B维持3～5d，至脂滴增大，进行油红O染色；倒置光学显微镜下观察并拍照记录。

1.2.4 大鼠皮肤深度烧伤模型的建立 将SD大鼠用10%水合氯醛（剂量0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，麻醉满意后用电推剪和脱毛剂去尽大鼠背部体毛；常规消毒铺单，在大鼠背部两侧分别暴露直径约25mm圆形皮肤，其余皮肤覆盖隔热板保护，在皮肤暴露处涂抹固体酒精，迅速点火燃烧30s达Ⅲ°烧伤；医用无菌手术剪沿大鼠背部焦痂边缘将其全层剪除；模型建立过程见图1。

图1 大鼠Ⅲ°烧伤模型建立过程（a：大鼠背部对称备皮；b：固体酒精烧伤，可见创面基底白色皮革样变；c：焦痂切除术后）

1.2.5 大鼠深度烧伤治疗模型分组 根据自身对照实验要求，将大鼠深度烧伤治疗模型分成两组。实验组为人工真皮+ADSCs治疗，取ADSCs细胞悬液（浓度为1×106个/ml）多点注射于大鼠背部左侧创面及创周皮下，将人工真皮修剪至与大鼠背部创面等大，将其海绵层紧贴创面，用5-0丝线缝合硅胶膜与创缘。缝合固定。对照组为人工真皮+0.9%氯化钠注射液治疗，0.9%氯化钠注射液多点注射于大鼠背部右侧创面及创周皮下，将人工真皮修剪至与大鼠背部创面等大，将其海绵层紧贴创面，用5-0丝线缝合硅胶膜与创缘。分别于治疗后7、14、21d用数码相机拍摄大鼠背部创面并测量、记录其创面最大直径以评估创面愈合情况。

1.2.6 大鼠创面皮肤取材及处理 在术后21d时处死大鼠，常规消毒铺单，沿大鼠背部创面范围用无菌手术剪剪开皮肤，充分游离皮下后取下双侧创面皮肤组织，用于冷冻切片。在荧光显微镜下观察冷冻切片评估实验组与对照组创面情况。

1.3 统计学处理 应用GraphPad Prism5.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用配对t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠ADSCs的分离、培养结果 光镜下可见，ADSCs 1次传代后细胞呈梭形生长，原代及第2代细胞还有少量血细胞混杂，到第3代则较前明显纯净，第3～10代内细胞基本按对数生长，形态均一，见图2。

图2 大鼠第3代ADSCs光镜下所见（a：×40；b:×100）

2.2 大鼠ADSCs细胞表型鉴定结果 大鼠ADSCs高表达MSC标记物CD29、CD90、CD44，对于造血干细胞表面标志物CD34、白细胞共同抗原CD45则呈现低表达。大鼠ADSCs流式细胞图见图3。

图3 大鼠ADSCs流式细胞图

2.3 大鼠ADSCs多向分化能力鉴定结果 光学显微镜下可见，ADSCs经成骨诱导后茜素红染色下显现出深色钙结节，表明成骨细胞分化成功，见图4（插页）。ADSCs经成脂诱导后油红O染色下，可见细胞质内有大小不一的橘黄色脂滴，见图5（插页），表明成脂细胞分化成功。可见，ADSCs具有向成骨细胞、脂肪细胞分化的能力。

图4 大鼠ADSCs成骨分化光学显微镜下所见（茜素红染色；a:×100；b:×200；c:×400；d:油镜）

图5 大鼠ADSCs成脂分化光学显微镜下所见（油红O染色；a:×100；b:×200；c:×400；d:油镜）

图6 实验组与对照组创面愈合情况比较（a：治疗后；b：治疗后7d；c：治疗后14d；d：治疗后21d）

2.4 实验组与对照组创面愈合情况比较 治疗后7、14、21d两组创面愈合情况见图6（插页）；治疗后14d时，实验组创面最大直径明显小于对照组（P＜0.05），即实验组创面愈合速度比对照组明显增快，见图7。

图7 实验组与对照组创面愈合情况（最大直径）比较（a：治疗后7d；b：治疗后14d；c：治疗后21d）

2.5 治疗后21d实验组与对照组创面冷冻切片观察比较 治疗后21d，实验组创面在荧光显微镜下可见散在点状绿色荧光，而对照组未观察到明显荧光，见图8（插页）。

图8 治疗后21d实验组与对照组创面冷冻切片荧光显微镜下所见（a：实验组；b：对照组；×40）

3 讨论

ADSCs作为生物成体MSC的一种，广泛分布于各物种不同部位的脂肪组织中，其数量巨大，取材方便，体外扩增和自我更新能力很强；更重要的是其具有多向分化潜能，如分化为脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、表皮、肝细胞、造血细胞以及神经元细胞等[10]，ADSCs是真正意义上的具有多向分化潜能的干细胞。本研究结果显示，来源于大鼠的ADSCs具备良好的分化能力，可向成骨细胞、成脂细胞分化。

ADSCs具有MSC这一类细胞的特异性表面标志，表达大量的黏附分子，如持续表达CD9、整合素β1和α4、细胞间黏附分子1、CD105、血管细胞黏附分子和活化淋巴细胞黏附分子，表达Ⅰ类组织相容性蛋白HLA-ABC，但ADSCs并不表达造血细胞表面标志如CD14、CD34或CD45，不表达Ⅱ类组织相容性抗原HLA-DR及内皮细胞标志CD31，不表达共刺激因子B7-1、B7-2和CD40。ADSCs不表达MHC2Ⅱ类分子和B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，这样会导致效应性T细胞无法激活，使辅助性T细胞无反应性而促成免疫耐受，从而表现出这一更为重要的生物学特性——低免疫原性，这就使同种异体ADSCs移植变为可能，从而摆脱了必须自体干细胞回植的局限，大大提高了实用性。本研究中，流式细胞分析结果证明分离出的ADSCs表面标志物符合相关文献报道。同时，移植了ADSCs的大鼠创面并未出现严重的排异反应，亦有力地证明了ADSCs的低免疫原性。

近年来关于ADSCs促进烧伤创面愈合的研究已有了长足的进展[11]，如Lu等[12]发现直接将ADSCs注射到移植皮瓣下有助于创面愈合，然而类似治疗有诸多弊端，如排异反应明显、效果不稳定等，但其中最严重的是当干细胞离开创面局部环境进入血液循环后将表现出极高的癌变性进而造成肿瘤，这与干细胞本身的生物学特性有密切的关系[13]。

基于以上发展，近年来不少学者尝试以各种人工皮肤或真皮支架作为载体，将ADSCs种植于其表面或内部后应用于各种创面的治疗[14-18]，如Altman等[15]将ADSCs种植于两种细胞外基质支架（小肠黏膜基质支架、脱细胞真皮基质支架）及另外一种胶原-硫酸软骨素-透明质酸复合物支架，而Meruane等[18]将ADSCs种植于商品化的生物支架上，后将它们应用到了各种皮肤疾病模型的创面治疗上并收到了满意的疗效，并各自阐述了ADSCs在此种环境下促进创面愈合的机制。

胶原人工真皮是用组织工程学方法构建的可降解的真皮替代物，国际上最早形成商品并投入临床应用的是美国的Integra公司，随后全世界陆续有数种同类型产品上市，包括本研究中使用的日本人工真皮皮耐克。皮耐克是一种新型的由胶原蛋白海绵和硅胶膜组成的双层结构人工真皮，其内层海绵所含的胶原蛋白提取自猪肌腱，海绵厚度约3mm，具有多孔的三维结构，可为真皮再生提供支架，诱导真皮重建；其外层的硅胶膜则能够为创面提供机械保护和湿润环境，利于肉芽组织生长。近年来，学者们对于皮耐克的临床应用已经进行了大量实践与研究，发现皮耐克在治疗慢性创面[19]、皮肤撕脱伤[20]、深度组织缺损[21-22]等方面均有良好的临床效果。

本研究使用ADSCs联合人工真皮共同作用于创面，在治疗后7d时，两组创面最大直径并无统计学差异，而在治疗后14d时，实验组创面愈合速度比对照组要快。该结果表明，在深度烧伤创面愈合的中后期，ADSCs联合人工真皮能发挥更明显的作用，这应当与人工真皮内层多孔的三维结构和外层硅胶膜为细胞生长提供的良好空间、适宜微环境密不可分。同时，在本研究中，大鼠创面愈合后的皮肤组织冷冻切片在荧光显微镜下显示，实验组创面仍可见散在点状绿色荧光，提示人工真皮中的ADSCs在深度烧伤创面可长期存活，从而保证其在创面愈合的炎症期、增生期、重塑期持续发挥作用。

综上所述，ADSCs和人工真皮共同作用于大鼠深度烧伤创面，可促进其创面愈合，为临床深度烧伤的治疗提供了一种新思路。本研究阐述了ADSCs与人工真皮共同促进深度烧伤创面愈合的可行性，但由于创面愈合是一个极其复杂的生物学过程，存在多种细胞间的相互作用，因此，ADSCs联合人工真皮治疗的具体生物学机制仍不十分明确，仍有待进一步深入研究探讨。

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Adipose-derived mesenchymal stem cells combined with PELNAC for repairing deep burn wound in rats

FAN Youfen,LE Xin,JIN Guoying.Department of Burn Surgery,Ningbo No.2 Hospital,Ningbo 315000,China

ObjectiveTo assess the efficacy of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADSCs)combined with artificial dermis(PELNAC®)for repairing deep burn wound in rats. Methods ADSCs were isolated from adult SPF grade green fluorescent protein-transgenic rats.The specific cell surface markers of ADSC were analyzed with flow cytometry,the differentiation of ADSCs to osteoblasts was induced and the multilineage differentiation potential was observed.The third-degree burn wound model was induced on the back of Spregue-Dawley(SD)rats.The model rats were randomly divided into two groups:rats in test group(n=20)

ADSCs+PELNAC®for wound repairing and those in control group(n=20)received saline+PELNAC®.The maximum diameter of wound on d7,d14 and d21 after burns was measured,respectively.On the d21 the skin samples of burn area were taken to evaluate wound healing by frozen section. Results The ADSCs were successfully isolated,cultured,and identified.The ADSCs had the ability to proliferate continuously and showed characteristics of multi-potent mesenchymal stem cells.The results of flow cytometry showed that CD44,CD90 and CD29 were highly expressed in ADSCs,while the hematopoietic cell surface marker CD34 and leukocyte common antigen CD45 were lowly expressed.On the d14 after burns,the maximum diameter of the wound was significantly lower in test group than that in control group(P＜0.05).On d21 after burns,fluorescence microscope showed scattered fluorescence was distributed in ADSCs-transplanted wound tissue in test group,but not in control group. Conclusion The combination of ADSCs with artificial dermis(PELNAC®)can significantly accelerate wound healing,indicating that it might be an effective method for treating deep burn.

Deep burn Artificialdermis ADSCs

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-1744

浙江省医药卫生科技计划（2013KYB234）

315000 宁波市第二医院烧伤科

范友芬，E-mail：13906683613@163.com

2017-07-22）

（本文编辑：李媚）