海南发酵罗非鱼细菌多样性分析

王沛政,徐云升

(海南热带海洋学院 海南省海洋食品工程技术研究中心,海南 三亚, 572022)

(研究简报)

海南发酵罗非鱼细菌多样性分析

王沛政,徐云升

(海南热带海洋学院 海南省海洋食品工程技术研究中心,海南 三亚, 572022)

为了探讨海南发酵罗非鱼细菌群体结构多样性,本文采用 Hi Seq 测序平台,对发酵罗非鱼中细菌 16S DNA V3-V4 区进行测序分析.结果表明：发酵罗非鱼样品中细菌组成较为丰富.消化链球菌属(Peptostreptococcu)在发酵鱼样本微生物群落中所占比例为约33% ;其次为乳酸乳球菌属(Lactococcus),所占比例约为16%,这两个菌属是发酵罗非鱼的主要优势种群.变形杆菌属(Proteus)所占比例约为10%,摩根菌属(Morganella)所占比例约为8%,嗜冷菌属(Psychrobacter)所占比例约为8%,普罗威登斯菌属(Providencia)所占比例约为4%,链球菌属(Streptococcus)所占比例约为3%,肠杆菌属(Enterobacteriaceae_norank)所占比例约为2%.另外,样品中也检出少量有潜在危害的链球菌属等致病菌.

发酵;罗非鱼;微生物多样性

0 引言

罗非鱼是FAO(联合国粮农组织)向世界推广养殖的主要鱼类,也是我国农业部确定为我国淡水养殖的优势品种.海南是我国罗非鱼养殖的重要区域.发酵罗非鱼可以对海南罗非鱼养殖提供深加工的渠道,也能增加养殖户的收入.利用有益微生物对发酵过程进行有效控制有利于改善食品品质和保证食用安全,同时对发酵微生物群落结构进行有效调控,可以改善发酵品味和缩短腌制时间.近年来,国内外有关于发酵食品微生物多样性的不少研究报道,后立琼[1]报道了从苗族酸汤中分离得到Lactobacillusplantarum、Lactobacillusacidophilus、Lactobacilluslactis和Streptococcusthermophilus菌种.陈之兰等[2]报道西藏传统发酵乳中Lactobacilluscasei是优势菌群.Li等[3]报道云南景洪市和勐海县豆豉的主要优势菌种是Leuconostocmesenteroides和Staphylococcusgallinarum.高秀芝[4]报道东北传统发酵豆酱中优势细菌为Bacillus和Lactobacillus.Lee等[5]报道韩国八大传统发酵食品中微生物多样性非常丰富.这些研究报道为发酵食品中有益微生物的开发和利用提供了基础条件.目前未见海南发酵罗非鱼中微生物种群的相关报道.

传统的微生物鉴定方法很难鉴定众多的复杂微生物,随着生物技术的进步,细菌基因组序列近年来常被用于复杂微生物的鉴定.在细菌基因组中,16S rRNA基因长度在1500个碱基左右,含有9 个variable Regions (可变区域) 和10 个Conserved Regions (保守区域),其中可变区具有属或种的特异性.因此,16S rRNA被认为是最适于细菌分类鉴定的特征核酸序列.为了适用于高通量平台测序,考虑到测序平台读长的限制,目前高通量测序最常用的是V3,V3-V4和V6区[6-7].

为了探讨和开发海南发酵罗非鱼中的有益微生物,本文采用 Hi Seq 测序平台,对发酵罗非鱼中细菌 16S DNA V3 -V4 区进行测序分析,来揭示海南发酵罗非鱼中的细菌结构组成.

1材料与方法

1.1实验材料

发酵罗非鱼样品来自海南热带海洋学院食品专业自制.

1.2发酵罗非鱼样品微生物DNA提取

参照天根生化科技(北京)有限公司微生物基因组DNA提取试剂盒.

1.3琼脂糖凝胶电泳

Nano Drop分光光度计检测DNA浓度,琼脂糖电泳上样体积为 2 ul,1%琼脂糖凝胶,电泳缓冲液为0.5TBE,100V电泳60 min.染色时放在含有溴化乙锭的染色液中染色30 min,在254 nm的紫外灯下观察.

1.4 PCR扩增反应及程序

PCR 扩增包括10×Buffer(含MgCl2) 3 μL,2.5mM dNTPs 1.0 μL,5u TaqDNA聚合酶0.1 μL,10uM正向和反向引物2 μL,模板2 μL,ddH2O 6.9 μL,总体积为15 μL.

PCR反应程序：94℃预变性2 min;94℃变性30 s、52～60℃退火30 s、72℃延伸45 s,共计30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存.

1.5发酵罗非鱼样品微生物多样性检测

发酵罗非鱼DNA 样品微生物16S V3-V 4多样性委托国家基因组北方中心诺赛基因组研究中心检测.

2 结果与分析

图1 发酵罗非鱼DNA样品扩增结果

2.1发酵罗非鱼DNA扩增质量琼脂糖电泳检测分析

发酵罗非鱼DNA样品扩增结果有目的条带(图1中第1泳道),琼脂糖凝胶电泳 NTC为空白对照(图1中第2泳道),且空白对照无条带,所以样品的PCR扩增结果合格.

2.2发酵鱼样本细菌群落结构分析

发酵鱼样本微生物群在纲(Class)水平的群落结构结果如图2所示,图中可以看出Gammaproteobacteria (γ-变形菌纲) 在发酵鱼样本微生物群落结构中所占比例最高为 37%;其次为Clostridia (梭状芽胞杆菌纲) 所占比例为33%;Bacilli (杆菌纲)排第三所占比例为26%;Alphaproteobacteria(变形菌纲)所占比例为1%.以上四种合计占发酵鱼样本微生物群落结构比例达97%.

图2 发酵鱼样本细菌群纲(Class)分类水平的群落结构

图3 发酵鱼样本微生物群科(Family)分类水平的群落结构

发酵鱼样本微生物群在科水平的群落结构结果如图3所示,图中可以看出Clostridia (梭状芽胞杆菌纲)中的Peptostreptococcaceae(消化链球菌科)在发酵鱼样本微生物群落结构中所占比例最高为 33% ;其次为Gammaproteobacteria (γ-变形菌纲) 中的Enterobacteriaceae (肠杆菌科) 所占比例为25%;Bacilli (杆菌纲) 中的 Streptococcaceae (链球菌科)排第三所占比例为18%;Gammaproteobacteria (γ-变形菌纲) 中的Moraxellaceae(莫拉菌科)所占比例为6%;Bacilli (杆菌纲) 中的Staphylococcaceae(葡萄球菌科)所占比例为4%;Enterococcaceae(肠球菌科)所占比例为3%,Vibrionaceae(弧菌科)所占比例为1%.以上合计占发酵鱼样本微生物群落比例达95%.

图4 发酵鱼样本微生物群属(Genus)分类水平的群落结构

发酵鱼样本微生物群在属水平的群落结构结果如图4所示,图中可以看出Clostridia (梭状芽胞杆菌纲)中的Peptostreptococcu (消化链球菌)在发酵鱼样本微生物群落结构中所占比例最高为 33% ;其次为Bacilli (杆菌纲) 中的Lactococcus (乳酸乳球菌) 所占比例为16%;Gammaproteobacteria (γ-变形菌纲) 中的Proteus (变形杆菌)排第三所占比例为10%; Morganella(摩根菌属)所占比例为8%; Psychrobacter(嗜冷菌)所占比例为8%;Bacilli (杆菌纲) 中的Providencia(普罗威登斯菌)所占比例为4%;Streptococcus(链球菌)所占比例为3%;Enterobacteriaceae_norank(肠杆菌)所占比例为2%.以上合计占发酵鱼样本微生物群落比例达90%.

3讨论

已有研究报道表明发酵水产品加工和保藏的优势菌主要是乳酸菌、微球菌和葡萄球菌、肠杆菌等.李改燕[8]确定了糟鱼发酵过程中的优势微生物菌群为芽孢杆菌、葡萄球菌、乳酸细菌和酵母菌.李燕等[9]对黄山臭鳜鱼发酵过程中微生物多样性研究发现Lactobacillus(乳酸菌)是主要优势菌.对比国外的鱼类发酵食品,Matsui等[10]报道日本传统发酵鱼(Saba-Narezushi)中主要优势菌种是Lactobacillus(乳酸菌)、Lactococcus(乳酸乳球菌)和Leuconostoc(明串珠菌),Kuda等[11]通过测定日本发酵鱼制品,发现乳酸菌和乳酸球菌为主要的微生物菌群.

本研究利用高通量测序方法从海南发酵罗非鱼样本中共检测到2个优势种群Peptostreptococcu(消化链球菌)和Lactococcus(乳酸乳球菌),以上这两种菌属占菌群体数目一半左右.Proteus(变形杆菌)、Morganella(摩根菌属)、Psychrobacter(嗜冷菌)、Providencia(普罗威登斯菌)、Streptococcus(链球菌)和Enterobacteriaceae_norank(肠杆菌)所占比例为10～20%之间.通过比较发海南发酵鱼中的优势菌与上述国内外报道所检测到优势种群有差异,这些差异可能是由于发酵方式不同及所在地域不同引起.本研究研究检测到有益菌种,例如Lactobacillus等对人体健康有特殊的保健作用,且在食品、饲料及医疗保健领域中享有重要作用[12].链球菌病是罗非鱼养殖首要病害,近年来暴发大规模链球菌病,使罗非鱼养殖户遭受严重的经济损失.本研究检测到在发酵鱼中检测到Streptococcus(链球菌),其所占比例为3%,因此在发酵罗非鱼加工中对原材料采购中有必要加强对链球菌的检测.

[1]后立琼.苗族酸汤中乳酸菌的分离鉴定及发酵动力学模型研究[D].雅安：四川农业大学,2012:1-3+44.

[2]陈之兰,杨吉霞,李梦寒,等.西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析[J].食品科学,2013,34(17):140-145.

[3]LI XR,LIU XF,ZHANG HY,et al.Microbial community diversity in douchi from Yunnan province using high-throughput sequencing technology[J].Modern Food Science and Technology,2014,30(12):61-67.

[4]高秀芝,易欣欣,刘慧,等.东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性[J].生物技术通报,2016,32(4):251-255.

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[6]MASELLA AP,BARTRAM AK,TRUSZKOWSKI JM,et al.PANDA seq:paired-end assembler for Illumina sequences[J].BMC Bioinformatics,2012,13(1):31.

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MicrobialDiversityinHainanFermentedTilapia

WANG Pei-zheng, XU Yun-sheng

(Hainan Ocean Food Engineering Technology Research Center,Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572200，China)

In order to investigate the diversity of bacterial population structure in Hainan fermented tilapia, V3-V4 regions of the bacterial 16S DNA were analyzed on the basis of theHiSeqsequencing platform.The results showed that the population of bacteria in fermented tilapia samples was abundant.Whereas, the proportion ofPeptostreptococcusin the microbial community of the fermented fish samples is about 33%, followed by that ofLactococcus—about 16%.These two genera are the dominant species in fermented tilapia.Meanwhile,Proteusis accounted for 10%;Morganella, 8%;Psychrobacter, 8%;Providencia, 4%,Streptococcus3%; andEnterobacteriaceae_norank, 2%.In addition, small amount of the potentially harmfulstreptococciwas also detected in the samples.

fermentation; Tilapia; microbial diversity

格式：王沛政,徐云升.海南发酵罗非鱼细菌多样性分析[J].海南热带海洋学院,2017,24(5):92-95.

2017-06-26

2016年海南省重大科技计划项目(ZDKJ2016009-03)

王沛政(1972-),男,陕西西安人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院教授,研究方向为分子生物学.

徐云升(1963-),男,辽宁辽阳人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院教授,研究方向为食品工程.

TS201.3

A

2096-3122(2017) 05-0092-04

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.16

(编校李由明)