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示踪剂技术用于废弃食用油脂快速检测与鉴别

2017-11-03金玲王鑫黄春燕梁恒兴万渝平吴文林

食品研究与开发 2017年21期
关键词:示踪剂罗丹明食用油

金玲,王鑫,黄春燕,*,梁恒兴,万渝平,吴文林

(1.成都中医药大学药学院,四川成都611137;2.成都市食品药品检验研究院,四川成都610045)

示踪剂技术用于废弃食用油脂快速检测与鉴别

金玲1,2,王鑫2,黄春燕2,*,梁恒兴2,万渝平2,吴文林2

(1.成都中医药大学药学院,四川成都611137;2.成都市食品药品检验研究院,四川成都610045)

建立荧光分光光度法和高效液相色谱-荧光检测法快速测定废弃食用油脂中示踪剂罗丹明B的方法。将添加了示踪剂罗丹明B的油样用无水乙醇提取后,分别采用荧光分光光度计和高效液相色谱-荧光检测器进行检测。结果表明,采用两种方法检测时,罗丹明B在0.5 μg/L~30 μg/L浓度范围内均呈良好的线性关系;检出限均为1 μg/kg;在10、50、100 μg/kg添加水平时,均能有效测定出示踪剂含量,两种方法均适用于食用油中非法添加废弃食用油脂的确证。本研究建立的基于示踪技术的废弃食用油脂快速检测手段和方法,可有效防止废弃食用油脂回流餐桌,确保我国食用油的安全使用,同时也为废弃食用油脂的监管提供新的思路与依据。

废弃食用油脂;示踪剂;罗丹明B;荧光分光光度法;液相色谱-荧光检测法

随着我国经济发展和居民生活水平的提高,食用油的消费量迅速增加。与此相应的,废弃食用油脂(又称地沟油、老油、潲水油)产生量也迅速增长。据统计,全国每年产生的废弃食用油脂至少有200万吨~500万吨。

食用油在反复煎炸后,营养成分大大降低,可能诱发多种疾病,甚至致癌[1]。因此,国家规定废弃食用油脂严禁在食品中使用。由于国外饮食习惯不同,加之较完善的法律系统,鲜有“地沟油”事件发生,因而主要针对废弃食用油脂生物利用方面进行研究[2-4],而国内,由于法律监管力度较低,尽管《食品安全法》中明确规定“禁止生产经营用回收食品作为原料生产的食品”以及2010年国务院办公厅发布《关于加强地沟油整治和餐厨废弃物管理的意见》(国办发 [2010]36号,意见要求)严厉打击非法生产销售“地沟油”行为,但废弃食用油脂成本低廉,监管复杂,使得一心想获取暴利的不法商家有机可乘,导致废弃食用油脂回流餐桌、流入食品生产中的现象屡禁不止。因此,如何保证精炼后的产品不再回流到食品生产和加工各环节,是目前的当务之急。

2011年12月,卫生部初步确定了4个仪器法和3个可现场使用的快速检测地沟油的方法,然而这些方法特异性不强,均不能作为“地沟油”判定手段。目前,废弃食用油脂的相关研究主要集中在依靠其自身成分和理化性质的检测方法研究方面,如采用电导率检测[5-6]、过氧化值测定[7]、酸价值测定[8]、胆固醇含量测定[9]、特征脂肪酸鉴别[10]等。同样,我国现行的国家强制性标准《食用植物油卫生标准》(GB 2716-2005)中,关于食用油的理化性质指标检测也仅仅包括酸价、过氧化值、浸出油溶剂残留、游离酚(棉籽油)、总砷、铅、黄曲霉毒素、苯并芘、农药残留9项指标。这些方法在一定程度上可以用于废弃食用油脂的部分检测,但是均存在一些缺点。由于经特殊加工处理后的废弃食用油脂与纯净合格食用油感官和性状上并无差别,而且主要是以一定比例掺入食用植物油的形式出售,常规检测方法难以鉴别,导致废弃食用油脂监管难度大,无法从根本上解决问题[11]。近些年来,近红外光谱[12-13]、傅里叶变换红外光谱[14-15]和拉曼光谱[16-17]的快速鉴别取得一些成效,先进的大型仪器设备也运用到这项工作中[18-19],但绝大部分方法仅仅是将食用植物油与废弃食用油脂区分开,且存在误判的可能性;其次,通过这些方法并不能准确判断掺入废弃食用油脂的比例,绝大多数方法使用的设备昂贵,操作步骤复杂,因此到目前为止,国内还没有公布有效的检测废弃食用油脂的方法。

示踪技术始于上世纪50年代,是指利用放射性或非放射性标记物在体内或体外跟踪其行径、转变和代谢等过程的技术[20],具有灵敏度高、测量方法简单、成本低、可准确定位等特点,因此广泛应用于油田开发[21]、水文地质工程[22]、生物医学[23-24]等领域。常见的示踪剂有化学示踪剂、同位素示踪剂、酶标示踪剂等。本实验所用的示踪剂为罗丹明B(Rhodamine B),又名玫瑰红B、碱性玫瑰精,是一种典型的化学示踪剂,也是一种常见的工业染料和化学分析试剂[25],具有摩尔吸光系数高、光稳定性好、波长范围宽以及量子产率高等优点,广泛应用在分子生物学、细胞生物学、荧光标记、荧光探针等方面[26]。

目前尚没有将示踪剂技术应用于废弃食用油脂追踪、鉴别的文献报道。本试验拟将示踪技术引入食用油中非法添加废弃食用油脂的鉴别研究,并与中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2430-2010[27]《进出口食品中罗丹明B的检测方法》进行对比,建立灵敏、简便、快速的检测方法,为食品监管部门对废弃食用油脂的安全监管提供支撑,保障我国食用油的安全使用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20组食用油样品:超市,2组废弃食用油脂:四川金德意饲料油脂有限公司。样品详细信息见表1。

表1 样品来源Table 1 Origins of sample

罗丹明B标准品、甲酸(色谱纯):美国Sigma公司;乙腈、甲醇(色谱纯):德国Merck公司;无水乙醇(分析纯):天津科密欧化学试剂有限公司;实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪(配荧光检测器):美国Thermo Fisher公司;RF-5301PC荧光分光光度计:日本Shimadzu公司;VORTEX 3旋涡混匀器:德国IKA公司;TGL-16M台式离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;KQ2200DV超声波清洗器:昆山超声仪器有限公司;Milli-Q纯水仪:美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 示踪剂的添加

为避免不同油样对罗丹明B提取的影响差异,现将罗丹明B标准溶液按10、50、100 μg/kg添加水平分别加入到22种样品中(n=6)。

1.3.2 标准溶液的配制

精密称取罗丹明B适量,用甲醇溶解,得到浓度为1 000 mg/L的标准贮备液。再分别准确量取贮备液适量,用甲醇稀释成 0.5、1、5、10、20、30 μg/L 6 个水平浓度,于4℃冰箱保存待用。

1.3.3 样品的制备

准确称取5.0 g食用油样品于50 mL离心管中,加入25 mL无水乙醇,涡旋混匀,超声15 min,5 000 r/min离心5 min,收集上清液。过0.22 μm有机滤膜,滤液分别供荧光分光光度计和高效液相色谱-荧光检测器测定。

1.3.4 荧光分光光度计测定方法

在激发波长(Ex)550 nm,发射波长(Em)580 nm的条件下,测定罗丹明B标准工作溶液的荧光强度,以荧光强度对相应的浓度作图,绘制工作曲线,然后在相同条件下测定样品中罗丹明B的荧光强度,再用回归方程求得含量。

1.3.5 液相色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX StableBond C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为甲醇乙腈溶液(甲醇∶乙腈=85∶15,体积比);梯度洗脱程序:0~8 min,60%B;8 min~12 min,60%~100%B;12 min~15 min,60%B。荧光检测器(FLD),激发波长(Ex)550 nm,发射波长(Em)580 nm。

2 结果与分析

2.1 罗丹明B的激发光谱和发射光谱

采用荧光分光光度计对罗丹明B标准工作溶液的激发及发射光谱进行扫描,所得激发及发射光谱如图1。

图1 罗丹明B的激发光谱和发射光谱Fig.1 Excitation spectrum and Emission spectrum of Rhodamine B fluorescein

由图1可知,罗丹明B在乙醇溶液中最大激发波长为550 nm,最大发射波长为580 nm。

2.2 助溶剂的选择

示踪剂罗丹明B易溶于水和无水乙醇,且具有一定的脂溶性。试验中发现,向食用油中直接添加罗丹明B固体,完全不溶。因此需考察多种助溶剂,使罗丹明B完全溶解于回收油。试验中考察了水、甲醇、乙腈、无水乙醇、异丙醇等5种溶剂,结果发现,罗丹明B和以上5种溶剂可以完全互溶,但回收油与罗丹明B的水、甲醇、乙腈和无水乙醇溶液无法互溶。而罗丹明B的异丙醇溶液,能够在较低比例下与回收油完全互溶。5 g油与1 mL异丙醇完全互溶,但是随着异丙醇的逐渐加入,二者逐渐不溶。由于该方法往回收油中添加罗丹明B的量远远小于上述比例。因此,最终决定采用异丙醇为助溶剂,将罗丹明B按一定量加入到油中。

2.3 提取溶剂的选择与优化

罗丹明B是酸碱两性化合物,易溶于水、甲醇、乙腈和无水乙醇。试验中选择了水、甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯∶环己烷(1∶1,体积比)作为提取溶剂。结果见图2。

图2 不同溶剂对罗丹明B提取率的比较Fig.2 Comparison of the extraction efficiencies of different solvent for Rhodamine B

由图2可知,在上述提取溶剂中水、甲醇、无水乙醇提取率类似,乙腈提取率次之,乙酸乙酯∶环己烷(1∶1,体积比)提取率最差。考虑到高效、低毒、成本低,初步筛选出水和无水乙醇两种提取溶剂。但水的密度较回收油高,不便于分离罗丹明B水层溶液。因此,最终采用无水乙醇作为提取溶剂。

2.4 提取溶剂体积的优化

优化提取溶剂的体积时分别选择10、15、20、25和30 mL进行考察,结果见图3。

图3 不同提取体积条件下的提取率Fig.3 Extraction efficiency under different extraction volume

由图3可知,提取率随着提取溶剂体积增大而增大,当提取溶剂体积为25 mL时,提取率不再提高。考虑到为使罗丹明B充分提出,因此,最终选择中间溶剂用量25 mL。

2.5 提取时间的优化

在一定时间范围内,提取效率和提取时间一般呈正相关关系。本试验进行超声提取时间的优化时分别选择 5、10、15、20 和 25 min 进行考察,结果见图 4。

图4 不同提取时间条件下的提取率Fig.4 Extraction efficiency under different extraction time

由图4可知,提取率随着提取时间的增大而增大。当提取时间达到15min以上时提取率几乎达到100%。因此,确定15 min为最佳提取时间。

2.6 流动相的选择

在考察流动相种类时,分别采用甲醇∶乙腈(85∶15,体积比)-水体系、甲醇 ∶乙腈(85∶15,体积比)-0.1%甲酸水作流动相对罗丹明B进行分离分析,试验发现甲醇∶乙腈(85∶15,体积比)-0.1%甲酸水体系作为流动相梯度洗脱罗丹明B的峰形较好,如图5C(以样品1为例)。因此,最终选择甲醇∶乙腈(85∶15,体积比)-0.1%甲酸水作流动相。

图5 罗丹明B标准品(A)、空白油样(B)、加标后油样(C)的高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of Rhodamine B(A),Blank sample of oil(B),Oil sample spiked with Rhodamine B(C)

2.7 线性关系

将“1.3.2”所配的标准溶液进行荧光分光光度计检测,以荧光强度(Int)对溶液浓度(X)进行线性回归,得到罗丹明B的标准曲线:Int=0.058 8 X+0.065 2(R2=0.999 9)。按照“1.3.5”的色谱条件,将“1.3.2”所配的标准溶液进行高效液相-荧光检测器检测,以峰面积(Y)对溶液浓度(X)进行线性回归,得到罗丹明B的标准曲线:Y=1 494.144X+327.535(R2=0.999 9);二者结果均表明,罗丹明B在0.5 μg/L~30 μg/L范围内线性关系良好。

2.8 检出限与定量限

对标准溶液进行逐级稀释,按3倍信噪比计算该方法的检出限,得出高效液相-荧光检测法检测时罗丹明B的检出限为1 μg/kg;按10倍信噪比计算该方法的定量限,得出该方法中罗丹明B的定量限为2.5 μg/kg。按照 LOD=3.3δ/S 公式计算。式中 LOD:检测限;δ:响应值的偏差;S:标准曲线的斜率[28]。经计算,得出荧光分光光度法的检出限也为1 μg/kg。

2.9 精密度与重复性试验

取5 μg/L的标准溶液,采用“1.3.4”的荧光分光光度计条件分析,连续6次测定,记录荧光光度值Int,计算6次测定的相对标准偏差为0.5%,表明仪器的精密度良好。配制加标量为50 μg/kg的1号样品6份,用荧光分光光度计测定并计算罗丹明B的含量,结果6份样品的相对标准偏差为0.9%,表明该方法重复性良好。

取5 μg/L的标准溶液,按照“1.3.5”的色谱条件,连续进样6次进行高效液相色谱-荧光检测法分析,测得罗丹明B峰面积的相对标准偏差为1.6%,表明仪器的精密度良好。配制加标量为50 μg/kg的1号样品6份,按“1.3.3”项下制备供试品溶液,按照“1.3.5”的色谱条件分析,计算罗丹明B的含量,结果6份样品罗丹明B峰面积的相对标准偏差为0.8%,表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收试验

按照“1.3.1”项下添加示踪剂罗丹明B,按照“1.3.3”项下制备样品,按照“1.3.4”和“1.3.5”项下的条件检测,计算罗丹明B含量和加标回收率,结果见表2。

表2 不同添加量的样品加标回收率(n=6)Table 2 Recoveries in different spiked samples(n=6)

续表2 不同添加量的样品加标回收率(n=6)Continue table 2 Recoveries in different spiked samples(n=6)

3 结论

本试验对20个批次的食用油和2个废弃食用油脂进行了示踪剂罗丹明B添加模拟试验,建立了用无水乙醇提取、高效液相色谱-荧光检测器和荧光分光光度法分别测定废弃食用油脂中示踪剂罗丹明B的检测方法。通过模拟添加试验,表明该方法能够有效地检测食用油中添加废弃食用油脂的情况。本试验选取荧光剂作为示踪剂,较紫外检测器灵敏度提高了3个数量级。经方法学验证,表明两种检测方法操作简单,灵敏度高,精密度和重复性好,结果可靠。且在油样前处理的过程中,省去了SN/T 2430-2010进出口食品中罗丹明B的检测方法中采用GPC净化的前处理步骤,样品只需经过纯无水乙醇提取后离心即可进样检测,前处理时间极大缩短,有机溶剂使用量也显著减少,操作检测更为快速。单用荧光分光光度法与用液相色谱-荧光检测法结果基本一致,在考虑快速检验的情况下,选择荧光分光光度计测定更为高效。

杜绝废弃食用油脂回流餐桌,就必须从源头上进行监管。判断油样品是否是废弃食用油脂,就目前已有的研究方法而言,所测指标种类较多,测定项目繁杂,设备昂贵,操作复杂,真阳性率结果较低。本试验仅需对加入废弃食用油脂中的示踪剂进行检测与追踪,“以一替多”地避免了检测项目的耗时、耗力、耗材,使得检测方法具备特异性。示踪剂的加入,如同给废弃食用油脂制定了特殊身份,一旦纯净的食用油样中检测出该物质,即可追踪此油的来源,这将显著提高了我国食用油中非法添加废弃食用油脂的监测力度,有利于食品安全保障工作的开展。本课题组将继续筛选多种示踪剂种类,并以不同的排列组合方式或添加方式定点用于固定生产企业,建立厂家的编码身份认证,通过特异性测定来实现废弃食用油脂的溯源。

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Tracer Technology Used for Rapid Determination and Identification of Waste Cooking Oil

JIN Ling1,2,WANG Xin2,HUANG Chun-yan2,*,LIANG Heng-xing2,WAN Yu-ping2,WU Wen-lin2
(1.Pharmaceutical College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan,China;2.Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu 610045,Sichuan,China)

To develop fluorescence spectrophotometry and liquid chromatography-fluorescence detector methods for quick determination of tracer agent Rhodamine B in processed products from waste cooking oil.The oil samples with tracer agent Rhodamine B were extracted with anhydrous ethanol,and then use fluorescence spectrophotometry and liquid chromatography-fluorescence detector methods to determine and analyze the processed extract respectively.The result showed that these two methods had a good linearity over the range of 0.5 μg/L-30 μg/L and the limit of quantification(LOQ)were 1 μg/kg.Beside that,the average contents detected at three spiked levels(10,50,100 μg/kg)were valid.Both methods can be applied to estimate adding condition of processed product from waste cooking oil in edible oil.This research based on the tracer technique in processed products from waste cooking oil for rapid detection means and methods,which can effectively prevent waste edible oil back to the table,ensure the safety of edible oil and provide new ideas and basis for regulation of waste cooking oil.

processed products from waste oil;tracer agent;Rhodamine B;fluorescence spectrophotometry;liquid chromatography-fluorescence detector

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.024

四川省科技计划项目(2012YQ09016705);成都市科技惠民项目(成科计[2013]44号)

金玲(1993—),女(汉),硕士研究生,研究方向:药物分析。

*通信作者:黄春燕(1981—),女(汉),助理研究员,硕士,研究方向:药物分析。

2017-08-23

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