超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

黄 刚，胡 凡，柴 文，文 安，刘诗英，吴晓牧

(江西省人民医院神经内科，南昌 330006)

超滤浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

黄 刚，胡 凡，柴 文，文 安，刘诗英，吴晓牧

(江西省人民医院神经内科，南昌 330006)

目的探讨离心超滤技术浓缩脑脊液检查结核杆菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在诊断结核性脑膜炎(TBM)中的价值。方法选取TBM患者40例(TBM组)和非TBM患者20例(非TBM组)，每位患者留取2份脑脊液(一份为原液，另一份为离心超滤浓缩)，使用ELlSA法检测其ESAT-6水平。结果TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用离心超滤浓缩技术能提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性，且操作简单，可作为快速诊断TBM的参照指标。

结核性脑膜炎； 早期分泌性抗原靶蛋白-6； 超滤浓缩;免疫组织化学； 脑脊液;诊断

结核性脑膜炎(TBM)是由结核分枝杆菌感染所致的高致残率及高致死率的中枢神经系统感染性疾病，在肺外结核所占的比例逐年增加。因其临床、症状体征无特异性，且脑脊液方面的检查特异性及敏感性亦较低，使得TBM早期诊断极易被误诊及漏诊。而脑脊液中的早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)检查被用于诊断TBM，其无浓缩的脑脊液ESAT-6检查特异性较高约为96.49%，而阳性率较低约为67.35%[1]，限制了其在临床的应用。因此，本研究利用离心超滤浓缩脑脊液技术提高ESAT-6检出的敏感性，以期达到快速诊断TBM的目的。

1 资料与方法

1.1病例资料

研究对象来自于2014—2016年江西省人民医院神经内科住院患者，其中TBM患者40例(TBM组)：依据Marais等[2]的诊断标准确诊，均为初次确诊未进行抗结核治疗，男20例，女20例，年龄14～72岁；非TBM患者20例(非TBM组)：男7例，女13例，年龄18～80岁，真菌性脑炎并肺结核1例，多发性硬化并肺结核1例，自身免疫性脑炎3例，单纯疱疹病毒性脑炎8例，带状疱疹病毒性脑炎7例。

1.2方法

检测方法：患者均在发病2周内行腰穿检查留取2份脑脊液，每份为3 mL。其中一份脑脊液通过超滤离心管，2500 r·min-1，30 min，浓缩为100 μL。均于-80 ℃保存，采用ELISA方法检测2份脑脊液中的ESAT-6水平，取9个质量浓度标准品(200、150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng·mL)及TBM组(原液和浓缩液)、非TBM组(原液和浓缩液),各100 μL，加入反应孔,置4 ℃冰箱过夜。冲洗2次，牛血清37 ℃封闭1 h；冲洗5次，加入二抗37 ℃孵育2 h；冲洗5次，加入辣根过氧化物酶20 min显色，然后加入100 μL终止反应的液体。按试剂盒提供的标准品为定性值，颜色较深为阳性，颜色较淡为阴性。敏感性=阳性数/总样本量×100%。

统计学方法：通过统计软件(SPSS16.0)对所得数据进行处理，2组比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2组原液和浓缩液ESAT-6检测结果见表1。TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性与原液比较差异无统计学意义(P>0.05)。非TBM组2例阳性分别为真菌性脑炎合并肺结核、多发性硬化合并肺结核患者。

表1 2组脑脊液ESAT-6表达情况

*P<0.05，#P>0.05与同组原液比较。

3 讨论

TBM是一种比较严重的肺外结核，占肺外结核的7%～10%[3]。其近年来发病率呈逐年升高的趋势，死亡率约为30%，致残率约为25%[4]，诊断治疗的延误是死亡率和致残率高的主要原因。但是现有的检查手段对该病的早期诊断、早期治疗仍然十分困难。目前临床上涉及TBM诊断的检查有脑脊液生化常规及细胞学、影像学检查、病原学检查、免疫学检查等。这些检查中：1)脑脊液生化常规及细胞学在TBM方面有特征性表现(如细胞学呈混合细胞反应)，但是TBM的脑脊液非常不典型，因此该检查只能作为参考。2)头CT或MRI在TBM诊断没有特征性表现故只能作为辅助。3)病原学检查是目前确诊TBM的方法，脑脊液抗酸染色的方法检出率较低，结核杆菌培养时间较长，通常要4～6周，阳性检出率只有20%～30%[5]，不利于TBM早期诊断。4)免疫学检查方法有两种，第一种为干扰素-γ释放试验，但它不能分辨结核感染是活动期还是既往感染，故不能作为单独诊断结核病的方法；第二种是脑脊液中的早期ESAT-6检查目前处于实验室研究，其特异性均在90%以上[1，6-7]。因此，检测TBM患者脑脊液中的ESAT-6很有可能成为早期快速精准诊断TBM的方法。

ESAT-6主要是结核杆菌早期分泌的抗原，具有较好的免疫原性，因此其特异性也较高，但是脑脊液原液检查ESAT-6不稳定，其敏感性在67.35%～88%[1，6-7]之间，使得其临床应用前景并不乐观。造成ESAT-6不稳定的原因可能为：与患者颅内结核杆菌感染的严重程度有一定的相关性，感染重的患者颅内结核杆菌数量较多，其分泌的ESAT-6抗原的量较大，浓度高，容易检测到；而感染较轻的患者结核杆菌数量少，其脑脊液的ESAT-6抗原量少浓度低，检测时容易出现阴性的结果。故本研究利用离心超滤的技术解决脑脊液原液中ESAT-6抗原浓度较低的缺点，浓缩TBM患者的脑脊液，提高脑脊液中ESAT-6抗原的浓度。

本研究中，TBM组选取首次确诊为TBM的患者(未使用抗结核治疗)40例，留取2份脑脊液(一份为原液，另一份为离心超滤浓缩)，原液检测ESAT-6抗原发现有32例为阳性，8例为阴性，敏感性为80%，8例阴性患者病情都较轻；通过离心超滤浓缩脑脊液检测ESAT-6抗原，其敏感性为100%，TBM组中浓缩ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)。提示通过离心超滤技术能够改善轻症患者的假阴性的结果。另外，非TBM组中出现了2例脑脊液原液检测为阴性，但是浓缩后脑脊液检测为阳性,1例为多发性硬化合并肺结核的患者，另一例为真菌性脑膜炎合并肺结核患者，进一步检测这2例患者血中的ESAT-6抗原亦为阳性，出现这种情况的原因笔者考虑：1)这2例患者患有肺结核，肺部的结核杆菌会产生ESAT-6抗原并释放进入血液。2)中枢神经系统疾病破坏了患者的血脑屏障，导致血液中的ESAT-6抗原部分进入中枢神经系统，脑脊液中的ESAT-6抗原浓度较低，导致了原液检测为阴性，浓缩后检测为阳性。临床对于这类患者可通过脑脊液生化、常规、细胞学、抗酸染色及影像学等进行鉴别诊断。

总之，利用离心超滤浓缩技术能显著提高脑脊液ESAT-6检查的敏感性，可以作为TBM快速诊断的方法之一。由于ELISA是通过定性的方法进行判断实验结果，有其局限性，但是这种方法操作简单，容易判定结果，无需特殊的实验设备，适合在基层医院使用。

[1] 吴晓牧，刘丽娟，许志强，等.早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6[J].中国免疫学杂志，2012，28(4)：347-350.

[2] Marais S,Thwaites G,Schoeman J F,et al.Tuberculous meningitis:a uniform case definition for use in clinical research[J].Lancet Infect Dis,2010,10(11):803-812.

[3] 张娟，蒋俊，张红，等.MGIT960与罗氏培养法在结核分枝杆菌培养及药敏试验中的比对分析[J].中国防痨杂志，2011，33(6)：361-365.

[4] Murakami S,Takeno M,Oka H,et al.Diagnosis of tuberculous meningitis due to detection of ESAT-6-specific gamma interferon production in cerebrospinal fluid enzyme-linked immunospot assay[J].Clin Vaccine Immunol,2008,15(5):897-899.

[5] Patel V B,Singh R,Connolly C,et al.Comparison of a clinical prediction rule and a LAM antigen-detection assay for the rapid diagnosis of TBM in a high HIV prevalence setting[J].PLoS One,2010,5(12):e15664.

[6] Kashyap R S,Ramteke S S,Morey S H,et al.Diagnostic value of early secreted antigenic target-6 for the diagnosis of tuberculous meningitis patients[J].Infection,2009,37(6):508-513.

[7] Song F,Sun X,Wang X,et al.Early diagnosis of tuberculous meningitis by an indirect ELISA protocol based on the detection of the antigen ESAT-6 in cerebrospinal fluid[J].Ir J Med Sci,2014,183(1):85-88.

(责任编辑：罗芳)

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10.13764/j.cnki.lcsy.2017.08.010