脂多糖连续注射诱发小鼠抑郁行为及认知改变*

袁 璐，李晋熙，罗跃嘉，3△.成都医学院 基础医学院(成都 60500)；.成都医学院第一附属医院(成都 60500)；3.深圳大学 深圳市情绪与社会认知科学重点实验室 (深圳 58000)

·论著·

脂多糖连续注射诱发小鼠抑郁行为及认知改变*

袁 璐1，李晋熙2，罗跃嘉1，3△
1.成都医学院 基础医学院(成都 610500)；2.成都医学院第一附属医院(成都 610500)；3.深圳大学 深圳市情绪与社会认知科学重点实验室 (深圳 518000)

目的观察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)连续注射5 d后实验动物的抑郁样行为及学习认知的改变。方法用侧脑室定位技术对实验组C57小鼠连续注射LPS 5 d，对照组小鼠注射相等体积的生理盐水。观察两组小鼠第2天的体质量，用糖水偏好实验、悬尾试验、旷场实验、高架十字迷宫实验、水迷宫实验等行为学实验检测实验小鼠行为学的改变。结果1)第6天行为检测时,实验组小鼠较对照组小鼠体质量更轻，差异有统计学意义(t=6.24, df=14,P<0.001)。2)糖水偏好实验中，实验组小鼠糖水偏好百分比明显低于对照组，差异有统计学意义(t=9.48, df=14,P<0.01)。3)悬尾实验中，实验组小鼠悬尾不动时间明显高于对照组，差异有统计学意义(t=4.43, df=14,P<0.01)。4)旷场实验中，实验组小鼠在旷场中的活动路程(t=4.59,df=14,P<0.001)、直立次数(t=5.27, df=14,P<0.01)、活动次数(t=4.93, df=14,P<0.001)明显低于对照组。5)高架十字迷宫实验中，和对照组比较，实验组小鼠在闭臂停留的时间更短(t=4.10, df=14,P<0.01)，在闭臂活动的速度更慢(t=12.84, df=14,P<0.001)，差异均有统计学意义。6)水迷宫实验中，实验组小鼠在第2天的逃逸潜伏期较对照组明显增多，在第5天撤去平台后穿越目标象限的次数较对照组更少(t=4.18, df=14,P<0.001)。结论LPS连续注射诱发了小鼠的抑郁样行为，且可影响实验小鼠的认知行为，是一个切实可行的抑郁模型，为慢性应激诱发的抑郁模型提供了更有力的支持，也为在此基础上抑郁的干预及调控提供了可能。

脂多糖；抑郁样行为；认知

抑郁状态是一种伴随多种精神生理症状，包括压抑、快感缺失、进食和睡眠障碍的情绪低落[1]。抑郁状态、抑郁症等负性情绪问题已经成为影响人们生活质量的重要问题。随着生活成本的增加和工作压力的累积，越来越多的人表现出抑郁状态，甚至出现抑郁症及抑郁症的反复发作，且持续时间长，影响范围广，后果破坏性大[2-3]。近年来，许多研究着力于改善和调节抑郁行为，旨在通过科学的机制机理研究，为抑郁症等负性情绪的治疗提供一些可能的靶点。抑郁行为内部机制的研究离不开实验动物模型的建立，以实验动物为研究对象，模拟与目标对象相似的行为，进一步探索行为背后脑机制的改变和信号通路的作用。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为效应性受体如CD14、TLR4的配体，可以特异性激活CD14、TLR4下游的信号通路，启动促炎症和抗炎症反应[4]。脑内LPS的刺激则可引起中枢内广泛的急性炎症反应，带来大脑环境的急性改变[5]。研究[6]表明，LPS一次注射后可引起实验动物的焦虑样行为；某些研究[7]认为，LPS注射的不同时间点及不同用量对负性情绪的影响程度也不同。但具体操作方案和程序有待进一步确认和完善。

本研究将连续5 d 侧脑室注射LPS的 C57小鼠作为实验组，注射相同体积生理盐水的小鼠作为对照组。观察第6天两组小鼠体质量的改变，并进行行为学观察。通过糖水偏好实验、悬尾实验、旷场实验、高架十字迷宫实验检测两组小鼠抑郁行为；通过水迷宫实验观察其认知变化。

1 材料与方法

1.1主要材料

实验小鼠为成都医学院实验动物中心提供的二级清洁动物。随机选取雄性8周成年C57小鼠32只，平均体质量20～22 g，取出后自由进水和饮食，分笼饲养，饲养温度控制在22 ℃。实验前1周由实验员将每只小鼠轻轻拎起，提前适应。将小鼠随机分为实验组(LPS组)和对照组(生理盐水组)，每组16只。

1.2实验方法

1.2.1 LPS连续脑室注射 随机选取C57小鼠8只，腹腔注射7%水合氯醛(0.1 mL/20 g)，麻醉时间<5 min，待完全麻醉后将实验动物固定于脑立体定位仪上，剪开头皮暴露颅骨，取0.3%双氧水擦拭颅骨，暴露Bregma位点，向侧脑室(Bregma向后0.34 mm,旁开1 mm,进针2.5 mm)埋管并用胶体固定，尽量不要触及其他脑区，用微量注射器向导管内注射LPS(2 mg/mL)。随机选取C57小鼠8只作为对照组，并采用同样的方法给予同剂量的生理盐水。持续注射5 d，每次间隔24 h。

1.2.2 体质量检测 持续注射LPS 5 d，实验者轻柔拎起小鼠，放入动物称量天平中称量两组小鼠的体质量并记录其改变。

1.2.3 糖水偏好实验 用1%糖水让小鼠适应48 h，禁水4 h，将两组小鼠分别置于放有1%糖水水瓶和自来水水瓶的饲养笼中。根据自来水瓶中的刻度变化观察并记录1 h 内每只小鼠对糖水和自来水的消耗量。

1.2.4 悬尾实验 糖水实验结束24 h后，对两组小鼠进行悬尾实验检测。将实验小鼠通过胶布固定在悬尾架正确位置，保持实验环境安静，摄像机自动记录小鼠5 min内的活动状态，行为学检测软件(smart软件)自动记录小鼠悬尾不动时间。

1.2.5 旷场实验 重复1.2.1的实验步骤，随机选取16只小鼠，分为两组，每组8只，持续注射LPS 5 d后，在第6 天将实验小鼠提前放置于旷场实验室适应环境。待小鼠适应环境后，将小鼠放置于旷场敞箱(100 cm×100 cm×60 cm)底面中心，箱壁四周及底面为白色。实验过程中保持安静，实验者同时进行摄像计时。旷场观察实验时间为10 min，在该时间内，行为检测软件(smart软件)自动记录小鼠在旷场中的运动路程、直立次数及活动速度，每次实验观察结束后用酒精对旷场装置进行清理，消除异味。

1.2.6 高架十字迷宫实验 旷场实验结束后，隔6 h探索小鼠在高架上的行为表现。高架为64 cm×64 cm的十字臂，包括一对开臂和一对闭臂。实验过程中保持安静，进行摄像计时。高架十字实验观察时间为5 min，在该时间内，行为检测软件(smart软件)自动记录小鼠在闭臂活动时间和速度，每次实验结束后用酒精对高架十字迷宫装置进行清理，消除异味。

1.2.7 水迷宫实验 高架十字实验结束后6 h，将小鼠放入水迷宫实验室提前适应。水迷宫是一个圆柱形箱体，箱体内注水，将稀释的牛奶倒入水中使箱体中的水呈白色。将黑色小鼠按固定象限放入水中，确保检测器可以检测出小鼠在水中的位置。前4 d进行学习训练，每组小鼠训练4次/d，60 s/次，若60 s后小鼠未能成功站上平台，实验者用接引棒引导小鼠上平台停留5 s。第5天撤去平台后，检测小鼠穿越平台的次数。

1.3统计学方法

2 结果

2.1小鼠体质量变化检测

通过体质量称量比较后发现，实验组小鼠的体质量是(18.45 ± 0.44)g，对照组小鼠的体质量是(22.25 ± 0.42)g，实验组小鼠的体质量较对照组明显下降，差异有统计学意义(t=6.24,P<0.001)(图1)。

图1 两组小鼠体质量比较注：与对照组比较，***P<0.001

2.2糖水偏好实验

实验结果显示，实验组小鼠糖水偏好百分比是(44.88 ± 2.81)%，对照组小鼠糖水偏好百分比是(76.38 ± 1.72)%，实验组小鼠较对照组小鼠对糖水的偏好降低，差异有统计学意义(t=9.48,P=0.004)(图2)。

图2 两组小鼠糖水偏好百分比注：与对照组比较，**P<0.01

2.3悬尾实验

实验结果显示，实验组小鼠悬尾后不动的时间是(56.63 ± 5.76)s，对照组小鼠悬尾后不动的时间是(28.88 ± 2.46)s，实验组小鼠悬尾不动时间较对照组明显增多，差异有统计学意义(t=4.43, df=14,P<0.01)(图3)。

图3 两组小鼠悬尾不动时间比较注：与对照组比较，**P<0.01

2.4旷场实验

旷场实验数据服从正态分布，统计结果显示，实验组小鼠在旷场中的活动总路程是(6 658.0 ± 490.1)cm，对照组小鼠在旷场中的活动总路程是(10 190.0 ± 593.9)cm, 实验组小鼠较对照组小鼠在旷场中活动的总时间明显减少，差异有统计学意义(t=4.59,P<0.001)。实验组小鼠的直立次数是(11.75 ± 1.16)次，对照组小鼠的直立次数是(22.00± 1.55)次，实验组小鼠较对照组小鼠在旷场中的直立次数显著减少，差异有统计学意义(t=5.27,P<0.01)。实验组小鼠在旷场中的活动速度是(7.38 ± 0.59)cm/s，对照组小鼠在旷场中的活动速度是(12.60 ± 0.87)cm/s，实验组小鼠较对照组小鼠在旷场中的活动速度明显减慢，差异有统计学意义(t=4.93, df=14,P<0.001)(图4)。

图4两组小鼠旷场行为表现比较

注：A：小鼠在旷场中运动总路程，与对照组比较，***P<0.001；B：小鼠在旷场中直立次数，与对照组比较，**P<0.01；C：小鼠在旷场中的活动速度，与对照组比较，***P<0.001

2.5高架十字迷宫实验

实验结果显示，实验组小鼠在高架十字闭臂中的活动时间是(254.70 ± 21.88)s，对照组小鼠在高架十字内闭臂的活动时间是(154.40 ± 10.97)s，实验组小鼠在高架十字中闭臂的活动时间显著高于对照组，差异有统计学意义(t=4.10, df=14,P<0.01)。实验组小鼠在高架十字实验中闭臂活动的速度是(32.75 ± 1.91)cm/s，对照组小鼠进入闭臂的速度是(161.90 ± 9.87)cm/s，实验组小鼠较对照组小鼠在闭臂活动的速度明显减慢，差异有统计学意义(t=12.84, df=14,P<0.001)(图5)。

图5 两组小鼠在高架十字中的行为表现

注：A：小鼠在高架十字闭臂滞留时间，与对照组比较，**P<0.01；B：小鼠在高架十字闭臂中活动速度，与对照组比较，***P<0.001

2.6水迷宫实验

水迷宫实验结果经方差分析后显示，实验组小鼠在第2天的学习潜伏期是(51.46 ± 3.54)s，对照组小鼠在第2天的学习潜伏期是(39.91 ± 3.34)s，实验组在第2天较对照组学习潜伏期更长，差异有统计学意义(P<0.01)。每天训练后实验组小鼠的学习潜伏期均高于对照组(P<0.01)，实验组小鼠需要花更长的学习记忆时间登台。第5天撤去平台后，实验组小鼠穿越平台的次数是(1.00 ± 0.37)次，对照组小鼠穿越平台的次数是(3.50 ± 0.46)次，撤去平台后，实验组小鼠穿越平台的次数明显少于对照组，差异有统计学意义(t=4.18, df=14,P<0.001)(图6)。

图6 两组小鼠在水迷宫中的行为表现

注：A：小鼠在水迷宫中前4 d的学习潜伏期，在第2天与对照组比较，**P<0.01；B：小鼠在水迷宫中穿越平台的次数，与对照组比较，***P<0.001

3 讨论

本实验用LPS持续5 d进行脑室注射，诱发小鼠抑郁样行为并观察其认知能力的改变[8]。LPS是Toll样受体4的配体，能够激活TLR4下游的信号通路，引发脑内的急性炎症反应[9]。持续5 d注射后，实验动物处于慢性炎性反应过程中，极有可能释放大量的促炎因子，这和抑郁症发病机理中细胞因子的假说相对应[6]。能否运用这种方式成功建造实验动物的抑郁模型是至关重要的因素，其有利于我们进一步对抑郁症的发病机制机理进行深入探索和研究，而抑郁伴随的认知能力改变也是抑郁症状的重要参考要素。

本研究在持续5 d脑室注射完成后通过实验动物体质量的增减，旨在检测其进食等是否出现异同。实验动物体质量减轻，表现出进食意愿减弱，一般可认为是抑郁行为的体现[10]。糖水偏好实验和悬尾实验是经典的抑郁行为检测实验，表现出明显抑郁行为的小鼠对糖水的偏好降低，这可能是因为抑郁的小鼠失去进食的欲望，对糖水的需求减弱[11]。悬尾实验中实验动物表现出悬尾不动即绝望，不反抗等行为则认为是抑郁的特征。而正常的动物则被一种求生与逃亡的本能驱使摆脱悬尾状态[12]。糖水偏好实验和悬尾实验的结果一致，实验组均表现出更明显的抑郁行为。在旷场实验中，啮齿类动物的嗜暗性会驱使小鼠在敞箱内不断探索，四处活动，而抑郁动物则表现出活动欲望降低，几乎静止在敞箱中不动，没有探索欲，基本不会有直立活动，其运动能力也受到极大影响[13-14]。本实验中，实验组小鼠在旷场的活动总路程较对照组明显减少，直立活动次数减少，运动速度缓慢，表现出探索欲、好奇心的丧失，长时间停留在敞箱的边缘并无运动探索欲望。高架十字迷宫的实验结果与旷场实验相呼应，在高架十字迷宫实验中，小鼠在高架十字中闭臂停留的时间较长，表现出怯于向外界探索，过多停留在较黑暗安全的闭臂。同时实验组小鼠在闭臂活动的速度也较慢，从实验观察中明显可以看出该组小鼠大量滞留在闭臂，与对照组小鼠的活跃探索相比，表现出更绝望探索欲丧失的行为。

本实验还采用水迷宫实验来初步探索小鼠认知能力的改变。一般认为小鼠在水迷宫中的逃逸潜伏期越长，表明小鼠的学习能力更弱，其要用更长的时间才能学会找到目标平台[15-16]。第5天撤去平台后，小鼠如果更多地在目标象限徘徊，表现出寻找平台的行为，则认为是记忆能力较好，即通过前4d的训练，观察小鼠第5天是否成功记住了平台所在的位置。实验结果显示，实验组小鼠在第2天的逃逸潜伏期较对照组明显增多，实验组在第2天学习找到目标象限的时间更长，到第4天后差异逐渐消失。撤去平台后，对照组小鼠更多地向目标象限探索并不断穿过目标象限，而实验组小鼠则表现出穿越平台的次数变少，一般可认为实验组小鼠的记忆能力较对照组小鼠更差。

综上所述，本研究通过LPS持续注射成功建立了抑郁模型，并用系统的行为学实验对其抑郁行为进行了详细观察和探索，为抑郁模型的建立提供了一定的实践基础。下一步可根据本研究中的抑郁模型老鼠，与成熟抑郁模型老鼠进行行为学实验比较，以更好确定本研究抑郁模型的可行性。在此基础上需进一步深入研究抑郁行为的干预和调节。本实验中水迷宫实验检测了其认知能力的变化，但关于认知能力改变与抑郁行为继发关系的探讨还较模糊，其实验数据有待进一步的补充和完善。

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AStudyontheDepressiveBehaviorandCognitiveDysfunctionInducedbyConsecutiveInjectionofLipopolysaccharide

YuanLu1,LiJinxi2,LuoYuejia1,3△.
1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.ShenzhenKeyLaboratoryofAffectiveandSocialCognitiveScience,ShenzhenUniversity,Shenzhen518000,China

ObjectiveTo explore the depressive behavior and cognitive dysfunction after consecutive injection of lipopolysaccharide (LPS) for five days.MethodsThe lateral ventricular localization technique was used to give the consecutive injection for five days to the C57 mice in the experiment group with LPS and the mice in the control group with the same amount of normal saline. The body mass of those mice was observed and their behavioral changes were tested by the behavior tests including the sucrose preference test, tail suspension test, open field test, elevated plus-maze and Morris water maze.ResultsThe body mass of the mice in the experiment group was significantly less than that of the mice in the control group on the 6th day of the behavioral tests(t=6.24, df=14,P<0.001). The mice in the experiment group showed less desire than those in the control group, and the differences were statistically significant in the sucrose preference test (t=9.48, df=14,P<0.01). The tail suspension time of the experiment group was significantly longer than that of the control group in the tail suspension test(t=4.43, df=14,P<0.01). The mice of the experiment group behaved significantly worse than those of the control group in the distance of activity (t=4.59, df=14,P<0.001), times of standing upright(t=5.27,P<0.01) and times of activity(t=4.93, df=14,P<0.001) in the open field test. The time of closed arm was significantly longer (t=4.10, df=14,P<0.01) and the speed was significantly lower(t=12.84, df=14,P<0.001) in the experiment group than in the control group in the elevated plus-maze. In the Morris water maze, the escape latency was elevated much more and the times of crossing the targeted quadrant were less in the experiment group than in the control group, and the differences were statistically significant (t=4.18,P<0.001).ConclusionThe consecutive injection of LPS induces the depressive-like behavior and affects the cognitive behavior of laboratory animals. It can also establish the depression model successfully, which can offer the strong support for the depression model induced by chronic stress and the potential to intervene and regulate depression.

Lipopolysaccharide; Depressive-like behavior; Cognition

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170918.1103.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.002

R285.5

A

国家自然科学基金重点项目(No:31530031)；国家自然科学基金面上项目(No:81471376)；国家973项目(No:2014CB744600)

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罗跃嘉，E-mail: luoyj@szu.edu.cn