振腹推拿对T2DM大鼠骨骼肌AMPK/Glut 4信号链的影响

王康 国生 钮妍 沈潜 薛恬珏 孟凤仙

·论著·

振腹推拿对T2DM大鼠骨骼肌AMPK/Glut 4信号链的影响

王康 国生 钮妍 沈潜 薛恬珏 孟凤仙

目的观察振腹推拿对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠腓肠肌及腹直肌组织AMPK及Glut4基因转录及蛋白表达的影响，探讨其改善T2DM糖代谢的作用机制。方法24只Wistar大鼠随机取出6只为空白组，其余高脂高糖饮食联合低剂量(35 mg/kg)链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM模型，成模大鼠随机分为模型组、西药对照组及西药推拿组。空白对照组及模型组每日灌胃蒸馏水，西药对照组每日以250 mg/kg标准进行二甲双胍灌胃一次，西药推拿组在相同给药标准基础上每日加用振腹推拿治疗一次。分别在干预第0、2、4、8周测定大鼠FBG水平，干预8周后，测定腓肠肌与腹直肌AMPKα2、Glut4基因转录与蛋白表达。结果与空白组比较，模型组FBG值在第0、2、6、8周时均显著上升，干预8周后，腹直肌AMPKα2及Glut4基因转录及蛋白表达均显著下降，腓肠肌AMPKα2基因转录及蛋白表达均显著下降，腓肠肌 Glut4蛋白表达显著下降。与模型组比较，西药组及西药推拿组FBG值在第2、6、8周时均显著下降，西药组腹直肌AMPKα2基因转录显著上升，Glut4基因转录及蛋白表达显著上升，西药推拿组腹直肌AMPKα2及Glut4基因转录及蛋白表达均显著上升，腓肠肌AMPKα2基因转录及蛋白表达均显著上升。结论在二甲双胍常规治疗基础上，联合振腹推拿可进一步改善T2DM大鼠的FBG水平，其对糖代谢的改善机制与调控骨骼肌AMPK/Glut4信号链有关。

振腹推拿； 2型糖尿病； 腺苷酸活化蛋白激酶； 葡萄糖转运蛋白4

据世界卫生组织统计，2005到2015年间中国由于糖尿病及相关心血管疾病导致的经济损失达5577亿美元，糖尿病患者数量从1980年的1.08亿增加到2014年的4.22亿[1]。2016年国家卫计委调查显示，中国糖尿病患者已达到1亿，其中约95%为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者，儿童青少年T2DM发病人数近年来迅速上升[2]。不断加深对T2DM发病机制的认识，积极寻找及推广符合中国国情与文化现状的治疗方式，对T2DM的早期防治有着积极的意义。

振腹推拿作为推拿学的一个重要流派，有其完整的理论体系和传承脉络，其临床特点是以松振法为核心的一系列手法作用于腹部经络腧穴，在内科病的防治中体现了环保与舒适的优势，与针灸、中药相辅相成，为西医控制不理想的内科疾病提供了互补性的治疗措施。近年来，振腹推拿广泛应用于T2DM的临床防治，并发挥了较好的临床疗效，但其作用机制的相关研究较少，本研究以细胞糖代谢的关键信号分子腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-mon- ophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]与葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4，Glut4)为切入点，从分子生物学的角度，初步揭示了振腹推拿改善T2DM糖代谢紊乱的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物

健康雄性SPF级Wistar大鼠30只，4周龄，体重(100±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心SPF级动物房，温度18～22℃，相对湿度40%～60%，自由进食和饮水。

1.2试剂及仪器

链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(美国SIGMA公司)，超纯RNA提取试剂盒(康为世纪生物)，HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪生物)，SYBR Green PCR Mixture (康为世纪生物)，大鼠AMPKα2Elisa试剂盒(华美生物工程有限公司)，大鼠GLUT-4 Elisa试剂盒(华美生物工程有限公司)。全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)，荧光定量PCR仪(ABI7500)，凝胶成像仪(Tanon-6600天能公司)，高速冷冻离心机(Hettich德国)，电热恒温培养箱(DH4000A天津泰斯特)，分光光度计(UV-2000上海尤尼柯公司)。

1.3模型建立与分组

将30只大鼠适应性喂养1周后随机取出6只作为空白组，其余24只给予高脂饲料喂养4周后禁食，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%浓度STZ，STZ配制过程避光并在冰浴中进行，15分钟内使用。空白对照组腹腔注射相同剂量柠檬酸缓冲液。3天后，以空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥11.1 mmol/L，视为造模成功。将造模成功的18只大鼠随机分为模型组、西药组、西药推拿组，每组6只。

1.4干预方案

于造模后进行干预，西药组给予二甲双胍灌胃，250 mg/kg，每日一次，共干预8周。西药推拿组在同样剂量药物基础上给予推拿手法干预，行拿揉法于大鼠双侧梁丘、血海二穴5分钟，频率(100±10)次/分钟；拇食二指拿揉双侧天枢穴5分钟；三指振腹法于小鼠神阙穴区域，施术5分钟，频率(200±20)次/分钟；手法合计15分钟，每日一次，共干预8周。空白组及模型组每日仅用鼠袋固定15分钟，不进行任何干预。

1.5组织标本采集及处理

大鼠在末次干预结束后，禁食12小时，第二天依次按50 mg/kg的剂量腹腔注射2%的戊巴比妥腹腔麻醉，腹主动脉取血后处死，冰浴下(4℃冰盘)取右侧腓肠肌及腹直肌。快速去除多余脂肪和结缔组织后，放入液氮保持，之后置于-80℃超低温冰箱保存，待测。

1.6指标检测

1.6.1 RT-PCR方法检测AMPKα2及GLUT4的mRNA转录水平 经典 Trizol法提取大鼠腓肠肌与腹直肌总RNA，按3 μg RNA逆转录合成cDNA。引物序列及产物长度见表1。以cDNA作模板，应用real-time PCR仪进行扩增，并计算相对2-ΔΔCt。

表1 各引物序列及扩增产物大小

1.6.2 ELISA方法测定腓肠肌AMPKα2及GLUT4含量 选取大鼠腹直肌与腓肠肌组织进行检测，严格按照ELISA试剂盒说明书检测GLUT4及AMPKα2的蛋白表达。

1.6.3 空腹血糖 强生稳豪快速血糖仪于造模成功后的第0、2、4、8周后分别测定各组大鼠FBG。

1.7统计学处理

2 结果

2.1对T2DM大鼠FBG水平的影响

干预前，模型组、西药组、西药推拿组与空白组比较，FBG值显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组、西药推拿组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明模型均一。

干预开始后的第2、4、8周，模型组FBG值高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组、西药推拿组与模型组比较，FBG值下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与干预前相比，西药组与西药推拿组在干预开始后的第2、4、8周，FBG值均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠干预前后FBG值比较

注： 与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与0周比较，cP<0.05。

2.2对T2DM大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA转录的影响

与空白组相比，模型组腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，西药组及西药推拿组AMPKα2及Glut4 mRNA表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)；西药推拿组较西药组对腹直肌AMPKα2mRNA表达的影响更为显著，与空白组水平更为接近，见表3。

表3 各组大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA转录水平的比较

注： 与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.3对T2DM大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，西药组Glut4蛋白表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)，西药推拿组AMPKα2及Glut4蛋白表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)；西药推拿组较西药组对腹直肌AMPKα2的蛋白表达的影响更为显著，见表4。

表4 各组大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表达水平的比较

注： 与空白组比较，aP<0.05； 与模型组比较，bP<0.05。

2.4对T2DM大鼠腓肠肌AMPKα2及Glut4 mRNA转录的影响

与空白组相比，模型组腓肠肌AMPKα2mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，西药推拿组腓肠肌AMPKα2mRNA表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)；西药推拿组较西药组对腓肠肌AMPKα2mRNA表达的影响更为显著，接近空白组水平，见表5。

表5 各组大鼠腓肠肌AMPKα2及Glut4 mRNA转录水平的比较

注：与空白组比较，aP<0.05； 与模型组比较，bP<0.05。

2.5对T2DM大鼠腓肠肌AMPKα2及Glut4 蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组腓肠肌AMPKα2及Glut4蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，西药推拿组AMPKα2蛋白表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 各组大鼠腓肠肌AMPKα2及Glut4 蛋白表达水平的比较

注： 与空白组比较，aP<0.05； 与模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

AMPK在进化上高度保守，是生物能量调节的关键分子，广泛表达于各种代谢相关的器官中，不同的组织和细胞中存在不同的同型异构体，分布在骨骼肌、心脏和肝脏的主要为α2亚型。它不仅作为调控糖脂代谢的重要激酶，同时也是参与炎症及自噬信号传导通路的关键蛋白[3]。

在T2DM患者、肥胖患者及相应的动物模型中发现肝脏、脂肪和肌肉等外周组织中的AMPK活性均下降，这一现象，被称为AMPK失调[4-5]，研究发现恢复AMPK信号网络的生理功能可从糖脂代谢、炎症反应及自噬等多途径改善T2DM的临床症状。其中，AMPKα2/Glut4信号链是该网络调控骨骼肌糖代谢关键通路，由于机体90%以上的葡萄糖代谢发生在骨骼肌内，因而恢复骨骼肌内AMPKα2/Glut4信号链的功能，对T2DM的血糖控制有着十分重要的意义。

近年来，随着国人疾病谱的改变，推拿运用到内、妇、儿科疾病的比率逐年上升。多项围绕T2DM的临床研究[6-9]指出，推拿联合常规降糖药物干预2型糖尿病患者，可减轻患者体重，并对血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸及胰岛素抵抗指数等水平具有较好的调节作用，同时改善胰岛素抵抗及血小板活化状态，且疗效优于单独应用西药，但对手法的效应机制尚缺乏深入的研究。

团队在前期工作中发现推拿手法对骨骼肌细胞AMPKα2含量有特异性调节作用，结合本次研究的结果，发现了在对T2DM大鼠模型进行干预时，在二甲双胍常规干预基础上加上振腹推拿，可提升大鼠血糖控制的稳定性及持续性；同时，使二甲双胍对AMPKα2/Glut4信号链的激活能力得到了一定程度的提升，表明振腹推拿可直接或间接上调骨骼肌AMPKα2的基因转录与蛋白表达，在腹直肌内可进一步表现出对AMPKα2/Glut4信号链的激活效应，从而达到稳定血糖与调节糖代谢的作用。

而振腹推拿在腓肠肌未能表现出对Glut4基因及蛋白的调控，其原因有以下几点：(1)手法操作范围：腹部操作范围较大，以面为主，腿部操作范围较小，以点为主；(2)肌肉被动运动方式：腹部操作以振法为主，肌纤维的运动是以整体的上下移动为主，力量柔和，腿部操作以拨法为主，肌纤维的运动则是以局部的左右摆动为主，力量偏强；(3)手法操作的时间：手法在腹部的操作时间是在腿部的两倍，导致一些时效性差异的出现；(4)与病变器官的相对距离：腹部操作的时候作用部位除骨骼肌外，还有胰脏、肝脏、腹部脂肪等组织器官，之间可能存在交互作用。由此可见，这一结果也从实验的角度说明了腹部手法的应用在T2DM的临床治疗中的重要性。

从胰岛素抵抗、炎症反应、氧化应激到线粒体功能障碍、自噬等，可以看出T2DM的发病机制是多方面的，因此推拿手法对其发挥的作用机制也将不是单一通路的，骨骼肌仅是手法作用的靶点之一，脂肪、肠系膜、腹腔脏器等组织器官也是手法的作用部位。本次研究结果初步揭示了振腹推拿干预T2DM的部分作用机制，发现手法可通过激活腹直肌AMPKα2/Glut4信号链发挥调控机体糖代谢的作用，四肢部的手法效应或通过其他途径发挥。今后的研究应在神经—体液—内分泌的大网络下，进一步研究推拿在靶组织、靶器官中产生的生物学效应，并探索其间的联系，方能更全面地揭示推拿手法的作用机制。

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[4] Dugan LL, You YH, Ali SS, et al. AMPK dysregulation promotes diabetes-related reduction of superoxide and mitochondrial function[J]. J Clin Invest, 2013, 123(11):4888-4899.

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EffectsofZhenfuTuinaonAMPK/Glut4signalchainofskeletalmusclesinratswithT2DM

WANGKang，GUOSheng，NIUYan，etal.DepartmentofTuina，DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China

Correspondingauthor：MENGFengxian，E-mail：mengfx_1955@163.com

ObjectiveTo observe the influence ofZhenfuTuinatreatment on AMPK and Glut4 gene transcription and protein expression in gastrocnemius and rectus abdominis tissues in rats with type 2 diabetes mellitus(T2DM), so as to investigate the mechanism of improving glycometabolism in T2DM.Methods6 Wistar rats were used as control group(C), 6 Wistar rats were given high-fat and high-sugar diets combined with intra-peritoneal injection with low dose (35 mg/kg) of streptozotocin to establish T2DM rat models. After successful established rat models, the rats were randomly divided into model group(M), western medication group(WM) and western medication combined withTuinagroup(WT). Rats in C and M were given daily intragastric administration of distilled water while rats in WT were given metformin (250 mg/kg), once per day. On the basis of WM group,ZhenfuTuinawas added in the WT group. All rats were sacrificed after 8 weeks of intervention, and the level of FBG and gene transcription and protein expression of AMPK and Glut4 in gastrocnemius and rectus abdominis muscles was detected.ResultsCompared with C group, level of FBG in M group was significant increase at 2, 6 and 8 week, gene transcription and protein expression of AMPKα2and Glut4 in rectus abdominis were significant decrease, gene transcription and protein expression of AMPKα2in gastrocnemius was significant decrease and the protein expression of Glut4 in gastrocnemius was decrease. Compared with M group, level of FBG was significant decrease of WM group and WT group at 2, 6 and 8 week. Compard wiht M group, AMPKα2gene transcription and protein expression of Glut4 in the rectus abdominis of WM was significant increase. Compared with M group, gene transcription and protein expression of AMPKα2and Glut4 in rectus abdominus of WT was significant increase.ConclusionOn the basis of conventional treatment of metformin, combined withZhenfuTuinacan further improve the FBG level in T2DM rats, and the mechanism is related to the improvement of glucose metabolism and the regulation of AMPK/Glut4 signaling chain in skeletal muscle.

ZhenfuTuina； Type 2 diabetes mellitus； Adenosine 5′-mon- ophosphate(AMP)-activated protein kinase； Glucose transporter type 4

R244.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.008

2017-02-25)

(本文编辑： 董历华)

北京中医药大学中青年教师项目(2016-JYB-JSPY-041)

100029 北京中医药大学东方医院推拿理疗科(王康、国生、沈潜)；北京中医药大学第三附属医院儿科(薛恬珏、钮妍)；北京中医药大学东方医院风湿免疫科(孟凤仙)

王康(1985- )，硕士，主治医师。研究方向：推拿改善代谢性疾病的分子机制。E-mail：wangkang_dfyy@163.com

孟凤仙(1955- )，女，博士，教授。研究方向：风湿免疫病、代谢病的中医临床及基础研究。E-mail：mengfx_1955@163.com