丹参多酚酸对2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质激活素A表达的影响研究

王玲 吴秋枫

丹参多酚酸对2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质激活素A表达的影响研究

王玲 吴秋枫

目的采用高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型，观察丹参多酚酸对其肾脏是否有保护作用及其保护机理。方法选取清洁级雄性SD大鼠50只，适应性喂养10天后随机分为正常组、糖尿病肾病组(模型组)以及丹参多酚酸低、中和高剂量治疗组，每组10只，模型建立成功后，正常组和模型组给予生理盐水0.1 mL/(kg·d)注射，丹参多酚酸低、中和高剂量分别给予丹参多酚酸10 mL/(kg·d)、20 mL/(kg·d)和40 mL/(kg·d)注射，8周后处死大鼠，检测血糖、胰岛素、24小时尿蛋白，同时HE染色观察肝脏病理学，免疫组化、Western blot和RT-PCR检测肾脏组织中肾小管间质激活素A(activin A，Act-A)的表达特点。结果与正常组相比，模型组血糖明显升高(P<0.05)，胰岛素明显降低(P<0.05)，丹参多酚酸治疗后，与模型组相比，高剂量组血糖明显降低(P<0.05)，胰岛素含量明显升高(P<0.05)，而中剂量组和低剂量组并没有差异；与正常组相比，模型组肾脏肥大指数、24小时尿蛋白以及Scr明显升高(P<0.05)，丹参多酚酸治疗后，含量均较模型组明显降低(P<0.05)；肾脏组织病理学可见，丹参多酚酸三个治疗组相较于模型组，炎症反应和肾间系膜增生明显减轻；此外，与正常组相比，免疫组化、Western blot以及RT-PCR可见模型组Act-A明显升高(P<0.05)，采用高剂量治疗后其表达明显降低(P<0.05)，随着给药剂量的增加，呈明显剂量依赖性。结论丹参多酚酸虽对降低2型糖尿病大鼠血糖以及提升胰岛素含量几乎没有作用，但其可明显改善肾脏24小时尿蛋白排泄，同时有效改善肾小管间质损伤，这可能与其可降低Act-A表达，进而延缓肾脏发生纤维化相关。

丹参多酚酸； 2型糖尿病； 肾病； 激活素A

近年来，随着人们生活水平的提高，过量碳水化物摄入增加，2型糖尿病的发生率也急剧增加[1]。2型糖尿病发生率增高，进而可引起糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病率增加[2]。最新的一份调查研究显示[3]，在世界范围内DN的发生率均呈高发的态势，以欧美国家为例，其发病率极高，占糖尿病人数的25%～42%，而中国目前还较低，为6%～10%。DN危害极大，其不仅表现有肾脏微血管的病变，同时也是导致肾小球硬化的危险因素，而肾小球硬化是糖尿病最为严重的并发症之一，也是引起患者死亡的主要死因[4]。丹参多酚酸注射液是目前临床中常用的一种稳定性心绞痛药物，其具有活血、化瘀、通脉的作用[5]，而课题组在临床研究统计中发现，糖尿病心脏损害的患者在给予注射丹参多酚酸后，其肾功能明显改善。因此通过建立2型糖尿病大鼠模型，给予8周丹参多酚酸治疗，以观察其对DN是否有治疗作用，及其作用的机制，为丹参多酚酸的开发和糖尿病肾病的治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1对象

选用SPF级雄性SD大鼠[湖北中医药高等专科学校实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2014-0017]，大鼠6周龄，体重180～220 g。大鼠购买后立即置于标准饲养间，适应性喂养期间由其自由饮水和饮食，控制明暗周期为12小时，温度保持在18～26℃之间，相对湿度控制65%～75%。

1.2实验材料与试剂

1.2.1 实验主要药品 链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司；丹参多酚酸购于天津天士力之骄药业有限公司。

1.2.2 实验主要试剂 水合氯醛购于上海生化试剂公司；Scr试剂盒、血糖测定试剂盒、胰岛素测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；柠檬酸钠缓冲液自行配制；0.9%氯化钠注射液购于广西裕源药业有限公司；Act-A抗体、ECL发光试剂盒购于美国Santa公司，胶卷购于柯达公司，引物由上海英俊公司设计并生产。其他常规试剂由武汉科技大学附属天佑医院生化实验室病理科提供。

1.3糖尿病大鼠模型的分组、制备与治疗

所有大鼠在适应性喂养10天后随机分为正常组、模型组以及丹参多酚酸低、中和高剂量治疗组。除正常组给予普通饲料外，其余4组给予高脂饮水1个月，1个月后正常组给予一次性腹腔注射用柠檬酸缓冲液，其余4组给予55 mg/kg STZ溶液,一次性腹腔注射造模。72小时后，检测其血糖水平，当连续7天血糖值大于等于15.6 mmol/L时确定造模成功。造模成功后，正常组和模型组给予生理盐水0.1 mL/(kg·d)大鼠体重注射，丹参多酚酸低、中和高剂量组分别给予丹参多酚酸5 mL/(kg·d)、10 mL/(kg·d)和20 mL/(kg·d)注射治疗。

1.4标本采集

1.4.1 实验大鼠尿液标本留取 分别于造模前、治疗4周后以及治疗8周后早上8点将大鼠置于金属代谢笼中，收集24小时尿量蛋白，并记录，尿液收集后将其统一保存于超低温冰箱中保存(-78℃)，以备统一检测定量。

1.4.2 实验大鼠血液标本留取 于实验第8周后处死大鼠，处死前先称重，之后给予2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(5 mL/kg)，麻醉后将其固定于解剖板，之后迅速打开胸腔，找到腹主动脉，用无菌注射器斜插进腹主动脉后取血，血液收集后置于1.5 mL离心管中离心，离心后收集血清，备用于检测相关指标。

1.4.3 实验大鼠肾脏组织标本留取 血液收集后，将大鼠双侧肾脏小心切除，切除后称重。之后统一切除肝左叶置于10%的中性福尔马林溶液中保存，备用于HE染色，其余置于灭活的冻存管中，同时置于超低温冰箱中保存备用(-78℃)。

1.5观测指标及方法

1.5.1 一般情况 在整个实验过程中密切监视大鼠的精神状态、毛色、大小便以及饮食特点，同时每周对其体重进行一次测量。

1.5.2 24小时尿蛋白排泄量 24小时尿蛋白排泄量由本院检验科完成，检测方法采用双缩脲法蛋白法，计算公式为：24小时尿蛋白排泄量(mg)=24小时尿蛋白浓度(mg/mL)×24小时尿量(mL)。

1.5.3 血清生化指标 血液Scr、胰岛素和血糖等生化指标的检测严格参照说明书进行即可，其中Scr和血糖检测仪器为分光光度计，胰岛素检测仪器为酶标仪。

1.5.4 HE染色 HE染色参照文献进行[6]，肾脏组织在用石蜡包埋后给予梯度酒精脱色处理，切片机切片后HE染色即完成，完成后使用盖玻片密封、光学图像采集显微镜照相即完成。

1.5.5 免疫组化 免疫组化的检测也参照文献进行[7]，中性树胶封片后，采用光学图像采集显微镜照片观察统计即可，以图片中棕黄色的位置、多少和深浅判定其表达量。

1.5.6 蛋白表达 Act-A蛋白的检测方法采用Western Blot法，具体为：(1)将100 mg的肾脏组织置于1 mL的总蛋白提取液中，之后研磨并提取上清液定量，在定量后调平，然后每组各取40 μg进行凝胶电泳，电泳完成后半干转移法转膜，转膜后采用脱脂牛奶密封2小时，2小时后洗涤三次，加入一抗过夜，之后再次洗涤三次后加入二抗密封2小时后即进行ECl发光显色胶片感光即可，完成后扫描图像，用Image J计算每个条带的灰度值，以Act-A/β-actin的灰度值设置为Act-A的相对含量。

1.5.7 半定量PCR Act-AmRNA的检测采用半定量RT-PCR法，取30 mg肾脏组织用Trial法提取总RNA，提取后定量调平，取2 μg逆转录，之后进行扩增，扩增条件为：95℃5分钟，94℃变性60秒，65℃退火60秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃最后延伸5分钟。在反应完成后，每组给取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，最后采用凝胶图像收集仪收集图像，image J计算光度值，以Act-A/β-actin的灰度值设置为Act-A的相对含量。具体引物序列见表1。

1.6统计学处理

2 结果

2.1大鼠一般情况

在整个实验过程中，正常组大鼠毛色光滑发白、饮食和饮水均正常，此外活泼好动，精神活跃；而模型组大鼠在整个实验过程中死亡2只，可能为血糖过高导致，同时其他存活的大鼠表现有明显的体型消瘦、饮水量和尿液量较多，毛色发黄、黏连等病理学特点；丹参多酚酸三个治疗组在整个治疗期间内没有死亡，但其基本症状并没有明显好转，与模型组一致，表现有明显的多饮多食、精神不活跃等。

2.2对实验大鼠24小时尿蛋白的影响

在造模前五个组别24小时蛋白尿并没有明显差异，而在治疗4周和8周后，模型组24小时蛋白尿明显高于正常组(P<0.05)，而丹参多酚酸三个治疗组相较于模型组则明显降低(P<0.05)，此外丹参多酚酸对24小时蛋白尿呈现明显的剂量依赖性。详见表2。

2.3对大鼠血糖和胰岛素含量的影响

与正常组相比，模型组血糖值明显升高(P<0.05)，此外胰岛素含量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，丹参多酚酸高剂量组血糖含量明显较低(P<0.05)，胰岛素含量明显升高(P<0.05)，而丹参多酚酸低和中剂量组则没有差异。详见表3。

表3 大鼠血糖值以及胰岛素含量比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

2.4对实验大鼠的血肌酐及肾脏肥大指数的影响

与正常组相比，模型组肾脏肥大指数以及肾功能指标Scr明显升高(P<0.05)，丹参多酚酸治疗8周后，与模型组相比，丹参多酚酸中剂量和高剂量组肾脏肥大指数明显低于模型组(P<0.05)，低剂量组则和模型组没有差异；此外，与模型组相比，丹参多酚酸三个剂量组Scr明显降低(P<0.05)，且呈明显的剂量依赖性。详见表4。

表4 大鼠肾脏肥大指数以及Scr含量比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0. 05。

2.5肾脏病理变化

肾脏组织病理学变化特点采用HE染色观察，由图1可以明显看出，正常组肾小管和肾小球结构完整形态规则，无任何增生反应， 而模型组则有明显的肾小球肥大症状，此外还表现有一定的肾小管萎缩，肾间质系膜增生。丹参多酚酸三个治疗组相较于模型组，症状明显好转，特别是上皮细胞空泡情况明显改善，同时增生情况也减弱，且随着丹参多酚酸给药剂量的增加，症状好转有进一步的剂量依赖性。

表1 大鼠心肌组织中Act-A引物

表2 各组大鼠24小时尿蛋白比较

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

图1 各组大鼠肾脏病理改变HE染色图(×200)

图2 各组大鼠肾脏组织中Act-A免疫组化图(×200)

2.6免疫组化

与正常组相比，模型组Act-A含量明显增高，丹参多酚酸治疗后，低剂量组相较于模型组只有略微改善，而中剂量组和高剂量组则有明显的改善，但相较于正常组仍有较高表达。详见图2。

2.7Western bloting和半定量PCR检测

正常组Act-A蛋白和mRNA表达较少，而模型组表达明显升高(P<0.05)，高剂量丹参多酚酸治疗后，相较于模型组，其表达量明显降低(P<0.05)。详见图3、图4和表5。

图3 大鼠肾脏组织中Act-A蛋白表达水平

图4 大鼠肾脏组织中Act-A mRNA表达水平

组别nAct-AmRNAAct-A蛋白正常组100.28±0.230.36±0.12模型组100.89±0.16a1.72±0.21a低剂量组100.63±0.15a1.01±0.22a中剂量组100.57±0.13a0.79±0.13a高剂量组100.42±0.13ab0.47±0.16ab

注： 与正常组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

3 讨论

糖尿病肾病是由糖尿病血糖升高等所带来的肾脏损害性疾病，目前随着糖尿病在中国的高发，糖尿病肾病发生率也逐年升高，因此也日益引起医学工作者的关注，关于其发病机制的研究也形成了众多的理论[8-10]。现有的研究证实，异常血糖升高的刺激、血管血流动力学的变化、代谢紊乱、氧化应激、炎症刺激等多种因素均可以造成糖尿病肾病的发生和发展。而上述的几条发病因素又相互影响，相互刺激，进而加重了本病的进展[11]。本次课题组采用高脂饮食加一次性链脲佐菌素构建糖尿病肾病模型，采用高脂饮食喂养比单纯性给予链脲佐菌素的优势在于其所造成的糖尿病肾病大鼠具有明显的胰岛素抵抗性质，与人体糖尿病发展模式相像，此外，采用链脲佐菌素一次性注射可以破坏大鼠的胰岛细胞，所造成的模型，更符合中晚期糖尿病特点。课题组采用丹参多酚酸治疗糖尿病肾病大鼠发现，虽然给予高剂量有一定的降低血糖的效果，但其使用剂量已经达到临床使用量的2倍，这可能带来新的问题。

丹参又名紫丹参、赤参、红根等，中医理论认为，丹参功效主要为：安神宁心，活血祛瘀，止痛，可治疗月经不调、痛经、血崩带下、经闭、瘀血腹痛、癥瘕以及心绞痛，此外对骨节疼痛、惊悸不眠以及恶疮肿毒具有较好的疗效[12-13]。丹参多酚酸是从丹参中提取的一类化合物，而多酚酸盐是目前临床中常用的一种冠心病稳定型心绞痛的药物，为浅棕色块状物，味道微苦，中医主要将其用于活血化瘀以及舒筋通络方面，因此在治疗心绞痛方面得到广泛应用[14-15]。而在临床治疗糖尿病心绞痛患者时，课题组发现其对糖尿病引起的肾脏损害具有很好的保护作用，因此考查丹参多酚酸对糖尿病肾脏损害是否有保护作用，研究结果证实，丹参多酚酸对糖尿病肾病大鼠肾脏肥大指数以及血清肾功能指标Scr有着很好的保护作用，且这种保护作用呈现明显的剂量依赖性，这进一步证实了其对糖尿病肾脏具有很好的保护作用。

丹参多酚酸对肾脏的保护作用可能与Act家族蛋白有关。Act家族蛋白最早发现于性腺，其是有二个13亚基的肽链借助于2硫键结合而成，主要功能是对细胞的生理过程起到调控作用，特别是对细胞增殖、凋亡以及代谢等的调控[16-17]。有研究显示[18]，Act一般在体内维持一个正常的平衡状态，其异常增高或者降低均会造成组织细胞分化，Act蛋白有多种，而与肾脏密切相关的为Act-A蛋白，国外有研究表明[19]，Act-A的过量分泌可以引起肾脏肾小管发生纤维化，进而引起肾脏肌纤维化，最终引起肾脏的损害，而糖尿病本身处于多种因子的刺激下，Act-A可能在肾脏的损害中起到促进作用，因此Act-A可以作为肾小管细胞转分化的一个标志。本研究发现丹参多酚酸可以明显降低糖尿病大鼠肾脏组织中Act-A蛋白的表达，组织炎症反应和增生反应明显减轻，其机制可能是通过调控Act-A蛋白表达实现的。尽管丹参多酚酸并不是一种有效的降糖药物，但是对降低大鼠24小时尿蛋白排泄、改善肾小管间质损伤和增生具有很好的作用，这可能与其可以抑制Act-A表达，进而延缓肾脏发生纤维化相关。

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EffectsofDanshenpolyphenolicacidonexpressionofactivinAofkidneytubeinterstitialintype2diabeticnephropathyrats

WANGLing，WUQiufeng.

TianyouHospitalAffiliated，WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430064，China

WUQiufeng，E-mail：hb70521@126.com

Salvia miltiorrhiza polyphenolic acid； Type 2 diabetes mellitus； Nephropathy； Activin A

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.006

2017-02-25)

(本文编辑： 董历华)

湖北省科技厅资助项目(2015CFC187)

430064 武汉科技大学附属天佑医院中医科

王玲(1982- )，女，硕士，主治医师。研究方向：中医基础与临床研究。E-mail：904719370@qq.com

吴秋枫(1966- )，女，本科，主任医师。研究方向：中医基础与临床研究。E-mail：hb70521@126.com

AbstracObjectiveTo observe the effects ofDanshenpolyphenolic acid on the renal function of rats with type 2 diabetes mellitus induced by streptozotocin and high fat diet, meanwhile, analyze its protective mechanism.MethodsFifty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, diabetic nephropathy group (model group) and low-dose, middle-dose and high-dose treatment group, 10 rats in each group. After the model was established successfully, the rats were given the corresponding treatment [normal group and model group was given 1 mL/(kg·d) rat body weight,Danshenpolyphenolic acid low, medium and high doses were givenDanshenpolyphenolic acid 5 mg/kg, 10 mg/kg and 20 mg/kg], 8 weeks after the rats were sacrificed, blood glucose, insulin and 24 hours proteinuria were measured. At same time, HE staining was used to detect liver pathology, Western blot, immunohistochemistry and RT-PCR was used to detect the expression of Act-A protein in interstitial.ResultsCompared with the normal group, the blood glucose level in the model group was significantly increased(P<0.05), the insulin was significantly decreased(P<0.05). After treatment withDanshenpolyphenolic acid, the blood glucose in the high dose group was significantly decreased(P<0.05), insulin was significantly increased(P<0.05), while there was no difference between the middle dose group and low dose . Compared with the normal group, the renal hypertrophy index, 24-hour proteinuria and Scr was significantly increased in the model group(P<0.05), and the salivaryol polyphenolic acid was significantly decreased(P<0.05). The pathological results of renal histopathology, in the three treatment groups compared with the model group, the inflammatory response and renal mesangial proliferation were significantly reduced after 8 weeks of treatment. In addition, the result of immunohistochemistry, Western blot and RT-PCR showed that compared with the normal group, the expression of Act-A in the model group was significantly higher than that in the control group(P<0.05), and Act-A was significantly decreased(P<0.05) after treatment withDanshenpolyphenolic acid.ConclusionDanshenpolyphenolic acid has little effect on reducing blood glucose and increasing insulin content in type 2 diabetic rats, but it can significantly improve urinary protein excretion and improve renal tubulointerstitial injury. And it can reduce Act-A expression, and thus delay the renal fibrosis associated.