应用HPLC法对肺宁合剂多成分含量测定研究

2017-11-03张登山邹静陈慧彭懿刘志辉

环球中医药 2017年11期

张登山邹静陈慧彭懿刘志辉

·论著·

张登山邹静陈慧彭懿刘志辉

目的建立高效液相色谱法同时对肺宁合剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素6种指标成分的含量测定。方法采用Hedera C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱，检测波长210 nm，柱温：30℃，流速：1 mL/min。结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的质量浓度在相应范围内呈良好的线性关系，线性范围分别为：16.20～518.2、9.741～311.7、37.27～1193.0、14.25～455.9、30.99～991.7、1.225～39.18 μg/mL，加样回收率分别为103.05%、95.29%、104.11%、99.78%、96.28%、105.42%。结论所建立的HPLC方法专属性强，重复性好，可用于肺宁合剂的质量控制。

肺宁合剂；盐酸麻黄碱；盐酸伪麻黄碱；苦杏仁苷；甘草苷；甘草酸；白花前胡甲素

肺宁合剂是江苏省中医院医疗机构制剂，是临床使用多年的有效制剂,由麻黄、苦杏仁、甘草、前胡、桔梗、瓜蒌皮、枇杷叶七味药组成，为中药复方制剂，具有止咳、平喘、化痰的功效[1]。由于早期医院中药制剂质量标准较低，仅有少量的定性鉴别、pH、相对密度等。而中药制剂定性定量控制的方法研究很多，如制剂中多成分的薄层定性研究，尤其是指纹图谱、特征图谱的研究与应用，多成分的含量测定方法的研究与制定，提高了中药制剂质量控制的水平。为提高肺宁合剂医疗机构制剂质量标准，确保制剂质量,本研究应用高效液相法进行了肺宁合剂多成分含量测定方法研究，以建立其多成分含量测定的方法与标准[2]。

1 仪器及试药

1.1仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪：G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1314A VWD检测器，Agilent chemstation工作站。十万分之一电子分析天平(BP-211D型，德国Sartorius)；百分之一电子天平(浙江凯丰集团有限公司，型号：KF10002)；水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，型号：LKTC-B1-T)；DW调温电热器(上海平环燃烧设备工程技术有限公司)；超声清洗机(上海科导超声仪器有限公司，型号：SK6200H)。

1.2试药

肺宁合剂(批号：1703037，1609121，1703039；江苏省中医院)；各阴性样品(实验室自制)；对照品盐酸麻黄碱(批号：171241-201508)、盐酸伪麻黄碱(批号：1237-9601)、苦杏仁苷(批号：110820-201506)、甘草苷(批号：111610-201607)、白花前胡甲素(批号：111711-200602)，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院，甘草酸(批号：160418)购于成都普非德生物技术有限公司，所有对照品均为含量测定用。乙腈为色谱纯(天津市四友生物医学技术有限公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1供试品溶液的制备

精密吸量取肺宁合剂4 mL，至10 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，超声15分钟，冷却，补足甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2混合对照品溶液的制备

分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素对照品适量，加甲醇制成分别含上述对照品518.2、311.7、1193.0、455.9、991.7、39.18 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.3阴性样品的制备

按制剂处方饮片剂量称取4份，分别除去麻黄、甘草、苦杏仁和前胡，按照生产工艺分别制成阴性制剂，按“2.1”项下制备阴性样品溶液。

2.4色谱条件及专属性试验[3-7]

采用安捷伦1100高效液相色谱仪，Hedera C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱(洗脱条件见表1)。检测波长：210 nm，柱温：30℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺麻黄阴性供试品溶液、缺苦杏仁阴性供试品溶液、缺甘草阴性供试品溶液和缺前胡阴性供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果见图1。图中可见各指标成分的分离良好，阴性样品溶液对测定无干扰。

表1 梯度洗脱程序表

2.5线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液，依次稀释得相应浓度的对照品溶液。分别精密吸取相应浓度的对照品溶液10 μL，按“2.4”项下色谱条件进样，测定，记录盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、杏仁苷、甘草苷、甘草酸和白花前胡甲素的峰面积。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归分析，得各对照品的线性方程及相关系数，见表2。结果表明，指标成分在线性范围内成良好的线性关系。

2.6精密度试验

分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μL共6份，按“2.4”项下色谱条件进样，测定，记录盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面积，计算RSD。结果各待测成分峰面积的RSD分别为0.87%、1.17%、0.34%、0.65%、0.32 %、0.75%。结果表明仪器的精密度良好。

注：1.麻黄碱；2.伪麻黄碱；3.苦杏仁苷；4.甘草苷；5.甘草酸；6.白花前胡甲素；A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.麻黄阴性溶液；D.苦杏仁阴性溶液；E.甘草阴性溶液；F.前胡阴性溶液

图1 肺宁合剂HPLC图

2.7重复性试验

取批号为1703037的肺宁合剂样品6份，依法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样10 μL，测定，记录供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面积，计算各待测成分峰面积的RSD分别为0.69%、0.35%、0.29%、3.44%、0.78%、0.76%。结果表明该方法的重复性良好。

2.8稳定性试验

取批号为1703037的肺宁合剂，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别依法于0、2、4、6、8、10、12、24小时进样测定，记录供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的峰面积，计算各待测成分峰面积的RSD分别为0.54%、0.37%、0.53%、0.35%、0.38%、0.49%。结果表明24小时内供试品溶液中各成分的稳定性良好。

2.9加样回收试验

精密量取已知含量的肺宁合剂(批号1703037)4 mL至25 mL量瓶中，精密加入约相当于含量100%的各对照品溶液，共6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的平均加样回收率分别为103.05%、95.29%、104.11%、99.78%、96.28%、105.42%，RSD分别为1.63%、4.64%、0.61%、1.15%、1.35%、2.32%。结果表明该方法的准确度良好，见表3。

2.10含量测定

取3个批次的肺宁合剂，照“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样检测，测定3个批次中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量，结果见表4。

表3 肺宁合剂各成分加样回收率试验结果表

表4 样品含量测定结果(n=3,mg/mL)

3 讨论

3.1测定目标成分的选择

肺宁合剂由麻黄、苦杏仁、甘草、前胡等7味中药组成，具有宣肺化痰、疏风止咳的作用。本制剂中，君药为麻黄、苦杏仁和甘草，配以臣药前胡。现代药理研究表明，麻黄发挥平喘和发汗作用的有效成分为生物碱类成分——盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱[8]。麻黄碱通过促进去甲肾上腺素和肾上腺素释放，间接发挥肾上腺素作用；直接兴奋α受体，使末梢血管收缩而缓解支气管黏膜肿胀，直接兴奋β受体，使支气管平滑肌松弛；麻黄碱和伪麻黄碱均有增加心输出量和升高血压的作用。苦杏仁具有降气止咳平喘、润肠通便的作用，主要含有的化学成分为苦杏仁苷，文献报道，苦杏仁苷具有镇咳祛痰、降血糖、降血脂等药理作用[9]。甘草具有镇咳平喘、抗炎等作用，主要成分为三萜类和黄酮类化合物，其中甘草酸和甘草苷分别是三萜类和黄酮类化合物重要的单体活性成分，具有很强的药理活性，比如抗炎作用、抗病毒、神经保护作用等[10]。前胡主治痰热喘满、咯痰黄稠等风热咳嗽痰多症状，以角型二氢吡喃香豆素类成分为主要的药效活性成分。白花前胡甲素作为香豆素类的主要有效成分，具有舒张肠管平滑肌和钙拮抗作用[11-12]。因此，本研究中选用肺宁合剂中比较有代表性的活性成分作为指标成分，进行样品的含量测定。

3.2检测波长的选择

对供试品溶液和混合对照品溶液中的待测成分在波长190～400 nm波长下进行紫外扫描。结果表明，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的最大吸收波长均为210 nm，其中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱只在210 nm处才有紫外吸收，甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素在210 nm波长处也有较强吸收。综合以上因素考虑，本试验选定210 nm作为检测波长。

3.3流动相的选择

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水系统，结果发现乙腈-水系统干扰较小且各指标成分分离效果较好，分析时间短，因此选择乙腈-水系统。为了改善峰形，需将流动相调整为弱酸性，提高分离度。本研究考察了0.05%、0.1%、0.2%的磷酸水溶液，结果发现，在0.1%磷酸水溶液的条件下，可以达到较好改善峰形的效果，因此，本研究选择乙腈-0.1%磷酸水作为流动相系统。由于梯度洗脱系统在达到乙腈-水=20：80的比例时，流动相黏度达到最大，流动性较差，压力升高，基线在35分钟时有向上浮动的趋势，但不影响指标成分的峰形和分离度。

3.4耐用性的考察

为考察色谱条件的耐用性，采用不同的柱温(25℃、30℃、35℃)、流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)、3种高效液相仪waters 2695-2998、Agilent 1100、Agilent 1260，以及不同品牌的同类型色谱柱Hedera C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。结果发现，测定条件小的变动对指标成分的峰形和分离度的影响较小，此色谱条件可靠，适用于日常含量测定。