血浆HS6ST2蛋白表达水平在肝癌诊断中的价值

崔艳霞 张丽君 杨玉秀

(郑州大学人民医院 消化内科 河南 郑州 450003)

血浆HS6ST2蛋白表达水平在肝癌诊断中的价值

崔艳霞 张丽君 杨玉秀

(郑州大学人民医院 消化内科 河南 郑州 450003)

目的研究肝细胞肝癌患者血浆中硫酸乙酰肝素6-O位硫酸基转移酶2(Heparan sulfate O-glucosaminyl 6-O-sulfotransferase-2，HS6ST2)蛋白的表达水平，评估其对肝癌的诊断价值。方法收集62例肝细胞肝癌、28例肝硬化及49名健康对照者的血浆，应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测HS6ST2及甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)的蛋白表达水平。结果HS6ST2蛋白在肝细胞肝癌患者血浆中的蛋白浓度中位数为37.46 ng/ml(1.69～65.32 ng/ml)，显著高于肝硬化组的4.35 ng/ml(0.38～26.58 ng/ml)，健康对照组的3.52 ng/ml(1.16～5.61 ng/ml)，差异有统计学意义(P<0.05)。HS6ST2蛋白表达与年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05)，与肝癌TNM分期及HBV病毒感染情况呈明显相关(P<0.01)。联合HS6ST2蛋白与AFP诊断的敏感度为87.4%，高于HS6ST2(74.2%)或AFP(69.4%)单独诊断时的敏感度。结论HS6ST2蛋白很可能成为肝癌诊断的一个新的血清学生物指标，HS6ST2蛋白和AFP联合诊断可提高肝癌的诊断敏感度。

肝细胞肝癌；硫酸乙酰肝素6-O位硫酸基转移酶2；甲胎蛋白；酶联免疫吸附检测

肝细胞肝癌是一种恶性程度较高的疾病，在世界范围内位居第5位，在我国恶性肿瘤病死率中居第3位[1]。其病因主要包括肝炎病毒感染、酒精、长期摄入黄曲霉素、自身免疫因素、寄生虫和遗传因素等。在肝癌发病早期，大多数患者的临床表现不典型，病情发展快、易转移，发现时已为中晚期，失去手术治疗机会，预后较差。因此早发现、早诊断、早治疗对于肝癌的预后至关重要。目前临床上常用的筛查方法是2012年美国国立综合(NCCN)癌症临床实用指南[2]所推荐的方法，即血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)检测联合肝脏影像学检查如B超、CT、MRI等。其中血清肿瘤标志物检测对肝癌的早期诊断、疾病进展的监测、判断预后及复发情况起重要作用。但AFP用于肝癌诊断时有30%～40%的假阴性率[3]，对肝癌的诊断并不理想，因此迫切需要具有高敏感度的肿瘤标志物以弥补AFP诊断的不足。在前期相关实验中我们应用基因芯片技术筛选出肝癌差异基因表达谱，发现硫酸乙酰肝素6-O位硫酸基转移酶2(heparan sulfate O-glucosaminyl 6-O-sulfotransferase-2，HS6ST2)是一个表达上调的基因[4]。有关研究结果提示HS6ST2在多种恶性肿瘤中高表达。目前已发现HS6ST2在卵巢癌[5]、胰腺癌[6]、乳腺癌[7]、结直肠癌[8]、肺癌[9]等恶性肿瘤中高表达，但是其在肝癌患者血浆中的表达情况仍鲜有报道。本研究应用酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)技术检测HS6ST2蛋白在肝癌患者、肝硬化患者及健康人群血浆中的表达水平，探讨其对肝癌的诊断价值。

1 材料与方法

1.1材料选取2015年12月至2016年4月在郑州大学人民医院(河南省人民医院)肝胆外科住院的62例肝细胞肝癌患者(肝癌组)，消化内科住院的28例肝硬化患者(肝硬化组)，以及同期体检中心的49例健康体检者(健康对照组)作为实验对象。62例肝细胞肝癌患者中，男42例，女20例，年龄为36～71岁，平均(54.52±8.68)岁，所有肝细胞肝癌患者均经过病理证实，收取标本前均未经过相关治疗。28例肝硬化患者均经影像学检查排除肝癌。所有参与者均签署知情同意书。本试验获得郑州大学人民医院研究伦理委员会批准。

1.2治疗方法

1.2.1标本采集 抽取参与者清晨空腹状态下外周静脉血5 ml，收集于EDTA-抗凝无菌管内。于室温下经离心机3 500 r离心15 min。收集血浆，置于-80 ℃保存待测定。

1.2.2血浆HS6ST2蛋白及AFP蛋白浓度测定 应用HS6ST2 ELISA试剂盒(美国MyBioSource公司)及AFP酶联免疫分析试剂盒(美国MyBioSource公司)说明书进行操作检测样本。应用96孔酶标仪(Bio-Rad公司)于450 nm下测得OD值，根据OD值建立标准曲线，计算出相应样本的HS6ST2与AFP的蛋白浓度值。

1.3统计学分析使用统计学软件SPSS 20.0处理数据，HS6ST2和AFP在样本血浆中的相对表达量用中位数(范围)表示。采用Kruskal-Wallis、Mann-WhitneyU、Spearman等统计学方法处理，采用受试者工作特征曲线(ROC curve)分析HS6ST2蛋白的诊断价值。

2 结果

2.1血浆中HS6ST2蛋白及AFP检测结果肝癌组血浆中HS6ST2蛋白浓度中位数为37.46 ng/ml(1.69～65.32 ng/ml)，明显高于肝硬化组的4.35 ng/ml(0.38～26.58 ng/ml)，健康对照组的3.52 ng/ml(1.16～5.61 ng/ml)，且肝癌组与肝硬化组、健康对照组之间差异均有统计学意义(χ2=42.8，P<0.05)。肝癌组血浆中AFP蛋白浓度中位数为255.37 ng/ml(2.42～415.76 ng/ml)，明显高于肝硬化组的13.24 ng/ml(0.19～81.62 ng/ml)，健康对照组的13.67 ng/ml(1.70～25.69 ng/ml)，且三者之间差异有统计学意义(χ2=33.3，P<0.05)(图1)。对所有样本血浆中的HS6ST2蛋白及AFP水平进行ROC曲线分析，HS6ST2蛋白表达水平的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.812(95%CI：0.730～0.894)，AFP蛋白表达水平的AUC为0.785(95%CI：0.690～0.880)，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明在所有样本中HS6ST2蛋白的诊断效果优于AFP(图2)。联合HS6ST2蛋白和AFP诊断肝癌时，敏感度可达87.4%，高于HS6ST2(74.2%)蛋白和AFP(69.4%)单独诊断。

A B

＊为在箱型区域之外的浓度数值。

图1肝癌组与肝硬化组、健康对照组HS6ST2蛋白(A)和AFP蛋白(B)水平比较

图2 肝癌组血浆中HS6ST2蛋白与AFP蛋白水平ROC曲线

2.2HS6ST2蛋白与患者临床病理资料相关因素关联性分析肝癌患者血浆中HS6ST2蛋白表达与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关(P>0.05)，与肝癌TNM分期及HBV病毒感染情况呈明显相关(P<0.01)。见表1，图3。

表1 肝癌患者血浆中HS6ST2蛋白与年龄等临床病理相关因素的相关性分析(ng/ml)

注：a为Mann-WhitneyU检验；b为Kruskal-Wallis检验。

A B

3 讨论

肝细胞肝癌是一种常见的恶性肿瘤，每年的发病率约为35/10万，严重危害人民健康及社会经济发展。目前临床上仍通过检测外周血中AFP含量筛查肝癌，研究证明AFP对肝癌的检出率是有限的[10]。因此探索新的血清标志物对肝癌的诊断及筛查至关重要。

硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)是一种广泛存在于细胞外基质和细胞膜中的线性硫酸化糖胺聚糖，与大量的配体相互作用，如生长因子、形态发生素、蛋白酶、病毒糖蛋白和基底膜成分等[11-13]。不仅参与各种细胞行为，如细胞生长、分化、黏附和迁移，而且参与细胞发展过程中组织形态的发生[14-15]。另外，HS参与多种病理生理现象如炎症、凝血、肿瘤细胞的恶化和微生物感染[16]。但是这些功能HS序列不是由基因直接编码的，而是由许多不同的高尔基固有酶催化合成的。HS的生物合成首先是由木糖基团结合在蛋白聚糖核心蛋白的特定丝氨酸残基上形成四糖核心，在四糖核心GlcA-Gal-Gal-Xyl(GlcA代表葡糖糖醛酸，Gal代表半乳糖，Xyl代表木糖)完成后，接着发生N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡萄糖醛酸 (GlcA)的交替添加[17]。HS结构和功能的多样性是通过各种HS修饰酶的作用产生的。这些修饰酶包括催化葡萄糖醛酸(GlcA)残基的C5位异构化反应转化为艾杜糖醛酸(IdoA)的C5-异构酶、催化艾杜糖醛酸残基的C2位的O-硫酸化的HS2STs、催化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基发生N-脱乙酰化和N-硫酸化的N-脱乙酰化/N-硫酸化酶(N-deacetylase/Nsulfotransferases, NDSTs)、催化N-硫酸化氨基葡萄糖(GlcNSO3)残基的C6位的O-硫酸化的HS6STs和催化N-硫酸化氨基葡萄糖(GlcNSO3)和氨基葡萄糖残基的C3位的O-硫酸化的HS3STs，最终形成了高度异构的复合物HS。HS与它的各种配体之间相互作用的特异性很大程度上取决于不同结构中的硫酸基团的数量和分布[18]。

大量的研究结果表明，HS6ST在各种发育过程中扮演着重要的角色。HS6ST基因家族包括HS6ST1、HS6ST2和HS6ST3，其表达产物是高尔基体内的一种Ⅱ型跨膜蛋白[18]。HS6ST能促进成纤维细胞生长因子(FGF)[19-21]、血管内皮生长因子(VEGF)[22]及肝细胞生长因子[8]等生长因子及其受体的形成，调节各种生长因子受体信号转导通路。而这些生长因子通过调节细胞生长及血管生成在恶性肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。近期研究表明，HS6ST1在卵巢癌细胞中异常高表达[23]。对于HS6ST3的研究报道较少。HS6ST2已被证明与多种恶性肿瘤细胞的发生发展有关[24]。Cole等[5]发现HS6ST2通过调节HB-EGF/EGFR信号通路及肿瘤细胞血管内皮生成因子的表达来诱导血管新生，导致卵巢癌的发生。Hatabe等[8]研究发现HS6ST2与结肠癌的发生发展密切相关，并可能成为评估结肠癌患者预后的有效指标。Song等[6]研究发现HS6ST2通过调节Notch信号通路诱导胰腺癌的发生。另外，HS6ST2与一些器官组织的形成有关，如血管内皮细胞及软骨细胞等的形成[22,25]。

本次研究发现，HS6ST2蛋白在肝细胞肝癌患者血浆中明显高表达，这与本课题组前期的研究结果相一致[4]。该结果说明HS6ST2蛋白可能作为肝癌的血清诊断标志物。且血浆中HS6ST2蛋白的表达与肝癌TNM高分期呈显著相关，也提示HS6ST2蛋白在评价肝癌患者预后方面具有一定的参考价值。ROC曲线分析结果也表明肝癌患者血浆中HS6ST2蛋白的诊断效果要优于AFP。而在联合HS6ST2蛋白和AFP诊断肝癌时，其诊断敏感度可达87.4%，明显高于HS6ST2蛋白和AFP单独诊断。这一结果提示HS6ST2在肝癌诊断中可能可以作为AFP的补充，提高肝癌的诊出率。但是HS6ST2蛋白在肝癌发生发展中的具体机制尚不清楚，还需进一步探索。其可能与HS6ST2蛋白增强生长因子的信号，导致肝细胞的恶性生长有关。

综上所述，HS6ST2蛋白有可能作为肝癌的辅助诊断标志物，但是仍需大规模的临床试验数据验证。

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DiagnosticvalueofHS6ST2proteinexpressioninplasmaforhepatocellularcarcinoma

Cui Yanxia, Zhang Lijun, Yang Yuxiu

(DepartmentofGastroenterologyandHepatology,People’sHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China)

ObjectiveTo explore and evaluate the diagnostic value of HS6ST2 protein expression in plasma for hepatocellular carcinoma.MethodsThe plasma of 62 patients with hepatocellular carcinoma, 28 patients with liver cirrhosis and 49 healthy individuals were collected. The protein expression levels of HS6ST2 and alpha-fetoprotein (AFP) were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe median of protein concentration of HS6ST2 protein in plasma of patients with hepatocellular carcinoma was 37.46 ng/ml (1.69～65.32 ng/ml), which was significantly higher than liver cirrhosis group [4.35 ng/ml (0.38～26.58 ng/ml)] and healthy control group [3.52 ng/ml (1.16～5.61 ng/ml) ], the differences between the three groups were significant (P<0.05). HS6ST2 protein expression, which was not associated with age, gender, and tumor size (P>0.05), was significantly associated with the hepatocellular carcinoma TNM staging and HBV virus infection (P<0.01). The sensitivity combining HS6ST2 protein and AFP was 87.4%, higher than that of HS6ST2 protein (74.2%) or AFP (69.4%).ConclusionHS6ST2 protein may be a new serological biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma, and the diagnosis combining HS6ST2 protein and AFP can improve the diagnostic sensitivity of hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma；heparan sulfate O-glucosaminyl 6-O-sulfotransferase-2；alpha-fetoprotein；enzyme-linked immunosorbent assay

杨玉秀，E-mail: yangyuxiu55@126.com。

R 735.7

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.20.002

2017-03-03)