QuEChERS-LC-MS/MS法测定水产配合饲料中4种常见黄曲霉毒素残留

李诗言，柯庆青，王鼎南，周凡，贝亦江，郑重莺，王扬

(浙江省水产质量检测中心， 浙江 杭州 310023)

QuEChERS-LC-MS/MS法测定水产配合饲料中4种常见黄曲霉毒素残留

李诗言，柯庆青，王鼎南，周凡，贝亦江，郑重莺，王扬*

(浙江省水产质量检测中心， 浙江 杭州310023)

采用改进的QuEChERS方法净化样品，建立水产配合饲料中4种常见黄曲霉毒素的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。样品经水相基质分散后酸化乙腈提取，获得的提取液再经增强型基质去脂吸附剂(EMR-lipid)脱脂, 盐析后经过N-丙基乙二胺(PSA)、氨丙基(NH2)、十八烷基键合硅胶(C18)和无水硫酸镁(MgSO4)吸附剂进一步净化并浓缩，然后用LC-MS/MS方法检测分析。结果显示：所有目标物在线性范围内线性良好，定量限均为1.0μg/kg。水产配合饲料中4个添加水平(n=6)的平均回收率为84.6%～104%，相对标准偏差(RSD)为3.5%～11%。该方法前处理操作简便，实验成本较低，灵敏度和准确度高，可实现水产配合饲料中4种黄曲霉毒素的准确测定。[中国渔业质量与标准，2017，7(5):25-32]

高效液相色谱串联质谱法；黄曲霉毒素；水产饲料；增强型去除脂类基质吸附剂；QuEChERS

黄曲霉毒素是一类聚酮衍生的呋喃氧杂萘邻酮物，具有高毒性和致癌性，目前已经发现近20种同系物，其中以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2最为常见[1-2]。水产配合饲料由于含有植物成分，极易被黄曲霉毒素所污染。有研究[3-5]表明虾、鱼等水生动物长期摄入含有黄曲霉毒素的饲料能够破坏其正常的免疫功能，造成其生长缓慢甚至发病死亡。中国农业行业标准NY5072—2002[6]对水产配合饲料中的黄曲霉毒素B1做了明确的限量要求，规定其最大残留量(MRL)为10μg/kg。为了水产养殖产业的健康发展和相关部门风险监管的需要，建立高效、准确、灵敏的水产配合饲料中多种黄曲霉毒素的分析方法十分必要。

黄曲霉毒素的检测方法主要包括酶联免疫法(ELISA)[7]、液相色谱法(HPLC)[8- 9]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[10-14]等，其中LC-MS/MS方法通量较大，无需衍生化且定性能力强，更适用于复杂基质中黄曲霉毒素的残留检测。由于饲料基质相对复杂，现有国家标准与文献报道多数采用免疫亲和柱[9,15]或者多功能净化小柱[14,16]对样品进行净化处理，虽能获得较好的净化效果，但步骤相对复杂，实验成本较高。目前QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)前处理技术已经广泛地应用在农药残留的分析检测中，其高效、快捷和绿色的技术理念使其在各类食品中黄曲霉毒素的检测工作中得到应用[17-19]。本研究建立了基于增强型去除脂类基质吸附剂(enhanced matrix removal-lipid, EMR-lipid)改进的QuEChERS 前处理方法，结合LC-MS/MS技术实现了水产配合饲料中4种常见黄曲霉毒素的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200 系列液相色谱仪(美国 Agilent公司)；4000 Qtrap 三重四级杆质谱仪(美国 AB SCIEX 公司)；Multi Reax全能型振荡器(德国 Heidolph 公司)；Allegra X-12高速离心机(美国 BECKMAN 公司)；5427R台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)；N-EVAP112水浴式氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates，Inc)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国TEDIA 公司)，实验用水为Milli-Q 高纯水，其余试剂均为分析纯。

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)，黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2),黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1),黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFG2),标准物质(纯度均大于95%，加拿大TRC公司)；增强型去除脂类基质吸附剂EMR-lipid (enhanced matrix removal-lipid)(美国Agilent 公司)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂、氨丙基(NH2)吸附剂、十八烷基键合硅胶(C18)吸附剂、中性氧化铝(Alu-N)吸附剂(博纳艾杰尔科技有限公司公司)；无水硫酸镁(分析纯，上海阿拉丁试剂)；DisQue盐析包(美国Waters公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；甲酸(色谱纯，美国ROE Scientific Inc.)。

1.2 样品制备

样品采自浙江省内水产养殖场，现场随机抽样，涉及中华鳖、对虾和鱼类配合饲料3个大类品种，数量共计88批次。按照GB/T 20195[20]要求对样品进行制样处理，饲料样品粉碎后过1 mm孔径的分析筛，混匀后装入密闭封口塑料袋中，避光冷藏保存。

1.3 样品前处理

准确称取饲料样品1.00 g，置于50 mL带盖的离心管中，加入10 mL超纯水，充分涡旋混匀1 min后，准确加入2.0 g EMR-lipid吸附剂，再加入10 mL酸化乙腈(含2%甲酸)，涡旋振荡提取10 min后5 700 g高速离心5 min，加入盐析剂(包含4.0 g无水硫酸镁，1.0 g氯化钠，1.0 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠)，混匀后在9 200 g下4 ℃离心5 min，待净化。

取上层乙腈相4 mL至15 mL带盖离心管中，准确加入600 mg无水硫酸镁、200 mg PSA、200 mg NH2和100 mg C18吸附剂后充分涡旋混匀1 min，5 700 g 高速离心5 min。准确移取2.5 mL上清液至具塞刻度玻璃试管，于40 ℃下水浴氮吹至近干，加入0.5 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,V/V)复溶，涡旋30 s，过0.22 μm有机滤膜过滤，待上机。

1.4 LC-MS/MS条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为Waters XSelect HSS T3(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)；柱温为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为10 μL。梯度洗脱程序：0～1 min， 80%B；1～4 min， 80%～60%B；4～10 min， 60%～20%B；10～11 min， 20%B；11～11.1 min， 20%～80B；11.1～18 min， 80%B。

1.4.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，正源模式，离子源温度550 ℃，电喷雾电压5 500 V，雾化气(GS1)压力379 kPa，辅助气(GS2)压力345 kPa，气帘气(CUR)压力172 kPa，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，优化后的质谱参数见表1。

表1 4种黄曲霉毒素的质谱参数Tab.1 Mass spectrometric parameters of 4 aflatoxins

注：*表示定量离子。

1.5 数据分析

采用SPSS 18.0软件进行两独立样本的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件优化

将1 mg/L的4种黄曲霉毒素标准溶液通过针泵进样进行质谱条件优化，黄曲霉毒素主要在正源模式下响应较高，主要形成准分子离子峰[M+H]+，确定目标化合物母离子后进一步进行碎片离子选择，优化后的4种黄曲霉毒素的MRM质谱参数见表1。

在优化色谱条件上，本研究首先比较了甲醇-水体系和乙腈-水体系对4种常见黄曲霉毒素质谱响应和峰型的影响。结果表明，G系列的两种毒素在乙腈体系中响应较高，这与胡文彦等[10]的研究结果相同。同时实验发现在流动相水相中添加少量乙酸铵和适量的甲酸能够提高待测物的灵敏度并且改善峰型，经过优化后本研究最终选用5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸，V/V)和乙腈作为流动相。在色谱柱的选择上，本研究比较了3根不同型号的色谱柱，型号分别是Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm × 150 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX XDB C18(2.1 mm × 150 mm，5 μm)和Waters XSelect HSS T3(2.1 mm × 150 mm，3.5 μm)。从色谱行为看，T3柱更适合黄曲霉毒素的分析，其填料粒径更小，柱效更高，此时4种黄曲霉毒素保留时间稳定且峰形良好(图1)。

图1 4种黄曲霉毒素的MRM谱图(1 μg·L-1)A:黄曲霉毒素B1和B2的提取离子流图；B:黄曲霉毒素G1和G2的提取离子流图。Fig.1 The extracted ion chromatography of 4 aflatoxins under MRM mode(1 μg·L-1)A：Extraction ion chromatography of Aflatoxin B1 and Aflatoxin B2; B：Extraction ion chromatography of Aflatoxin G1 and Aflatoxin G2.

2.2 样品前处理的优化

2.2.1 QuEChERS盐析方法的优化

4种常见黄曲霉毒素极性较弱，logP值均在2.0左右，通过两相盐析可以被有机层所萃取，因此适用于QuEChERS前处理方法。根据QuEChERS方法适用性要求并且参照文献[16]结果，本研究采用酸化乙腈(含2%甲酸)作为水产配合饲料中黄曲霉毒素的提取试剂。同时，实验考察了3种盐析剂(分别为原始QuEChERS方法、AOAC方法和CEN方法)对4种常见黄曲霉毒素提取效果的影响，结果表明柠檬酸盐缓冲体系的CEN方法能够获得较高的提取率(平均提取率为94%)，被选为本方法的盐析剂。此外，在前期试验中发现饲料基质脂类物质含量较高，提取液经过盐析萃取后乙腈层共萃物较多且颜色较深，根据本组之前实验经验[21]，在盐析提取步骤前加入了EMR-lipid吸附剂来吸附样品基质中的脂类物质会有效地减少该影响。对此，实验考察了样品量与EMR-lipid吸附剂添加量的最优配比，结果表明吸附剂添加量达到2.0 g时即可以满足样品的净化需求。图2中A瓶和B瓶的对比表明，配合饲料样品通过EMR-lipid吸附剂处理后盐析的乙腈提取液颜色更浅，溶液更加澄清透明，能够减轻后续净化的负担，提高净化效率。

图2 QuEChERS前处理方法的净化效果对比A:样品提取液盐析时未使用EMR-lipid吸附剂净化；B:样品提取液盐析时使用EMR-lipid吸附剂净化；C:经过多种吸附剂净化后的样品最终溶液。Fig.2 Comparison of purification efficiency by different QuEChERS methodsA:Sample solution after salting out without EMR-lipid purification; B:Sample solution after salting out with EMR-lipid purification; C:The final purification sample solution,which was cleaned up with many kinds of sorbents.

2.2.2 净化条件的选择

QuEChERS方法可选择的吸附剂种类众多，不同吸附剂在去除样品基质中干扰物的同时，也可能会对目标化合物进行吸附从而影响方法的准确性[18-19]。本研究考察了QuEChERS方法常见吸附剂对4种常见黄曲霉毒素吸附的影响，取2 mL质量浓度为10 μg/L的混合标准溶液，加入100 mg不同种类的吸附剂，充分混匀5 min，过膜后进行质谱分析，获得4种黄曲霉毒素在6种吸附剂处理后的回收率数据，并与空白对照组进行t检验分析。结果表明(表2)，GCB对目标化合物均具有较强的吸附作用，Alu-N对目标化合物也存在着一定的吸附作用，两组结果与空白对照组比较差异具有统计学意义(P< 0.05)，这可能是因为黄曲霉毒素为平面杂环结构，易被GCB和Alu-N所吸附；其余4种吸附剂MgSO4、PSA、 NH2和C18与空白对照组相比虽然目标化合物的平均回收率略有下降，但差异无统计学意义(P> 0.05)，说明其吸附作用不显著，这与郭礼强等[19]的研究结果相近。选用上述4种吸附剂作为后续的净化吸附剂，并对其使用量做了进一步优化，以3类典型水产配合饲料(中华鳖配合饲料，对虾配合饲料和鱼用配合饲料)中4种黄曲霉毒素的平均绝对回收率为判定依据，通过设计L9(34) 4因素3水平的正交实验，比较不同吸附剂(C18、 NH2、 PSA和MgSO4)添加量的净化效果。结果表明(表3)，影响回收率的主次顺序为：NH2>C18>PSA>MgSO4；根据正交实验结果，确认最优的净化吸附剂组合为100 mg C18、 200 mg PSA、 200 mg NH2和600 mg MgSO4。图2中C瓶和B瓶的对比表明，经过最优配比吸附剂净化后的样品溶液澄清透明，提取液色素明显减少，净化效果显著。

表2 不同吸附剂对4种黄曲霉毒素的回收率影响Tab.2 Influence of different adsorbents on recoveries of 4 kinds of aflatoxins n=6

注：*表示与空白对照组比较，P<0.05。

表3 吸附剂正交实验设计及结果Tab.3 Design and results of the orthogonal experiment for absorbents

注：T示单一因素水平的均值；R示T的极差值。

2.3 基质效应的影响

由于水产饲料基质较为复杂，在经过QuEChERS吸附剂处理后样品的基质效应仍然较强，目标化合物均存在一定的基质抑制作用(50%左右)。本研究将经过测试不含待测物的空白水产配合饲料样品按照1.3节方法进行处理，用获取的空白基质溶液配制基质加标标准溶液，以此校准样品的基质效应。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法的线性范围、回归方程与定量限

以空白配合饲料基质溶液配制成6种质量浓度的混合标准工作溶液系列梯度，通过各化合物的精确分子质量数，得到其提取离子色谱图。以提取离子色谱图的峰面积(Y)为纵坐标，化合物质量浓度(X，μg/L)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，结果见表4。4种待测物的线性范围均为0.5～100 μg/L，相关系数(r2)为0.997 3～0.999 6，表明各化合物具有良好的线性关系。采用标准添加法进行测定，以信噪比S/N大于3为方法的检出限，S/N大于10为方法的定量限(LOQ)，4种常见黄曲霉毒素的LOQ值均为1.0 μg/kg。

表4 4种目标化合物的回归方程、相关系数、检出限和定量限Tab.4 Regression equations, correlation coefficients(r2),LOQ and LOD of 4 kinds of analytes

注：AFB为黄曲霉素B；AFB2为黄曲霉素B2；AFG1为黄曲霉素G1；AFG2为黄曲霉素G2，下同。

2.4.2 回收率和精密度

分别向空白中华鳖配合饲料、对虾配合饲料和鱼用配合饲料中添加4个浓度水平梯度的4种黄曲霉毒素标准溶液，按前述前处理方法以及检测条件进行回收率实验(n=6)，具体结果见表5。基质中4种常见黄曲霉素的回收率为84.6%～104.0%，相对标准偏差(RSD)为3.5%～11.0%。与相关文献报道[14，16]相比，本方法4种黄曲霉毒素的整体回收率值更高，并且RSD值范围更低，表现出良好的方法稳定性。

表5 配合饲料中4种黄曲霉毒素的回收率和相对标准偏差Tab.5 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of 4 aflatoxins in formula feed n=6

2.5 实际样品检测

采用本方法对28批次对虾配合饲料、25批次中华鳖配合饲料和35批次鱼用配合饲料样品进行检测，结果如下：对虾配合饲料黄曲霉毒素B1检出率为43%，其中2批次样品黄曲霉毒素B1含量超过标准限量要求，分别10.1 μg/kg和15.6 μg/kg；中华鳖配合饲料黄曲霉毒素B1检出率为20%，含量范围为1.2～3.8 μg/kg，均未超过限量要求；鱼用配合饲料黄曲霉毒素B1检出率为51%，含量范围为1.2 ～9.1 μg/kg，均未超过限量要求。此外，88批次水产配合饲料样品中均未检出黄曲霉毒素G1和G2，但共有13批次样品检出黄曲霉毒素B2，含量范围为1.1～7.0 μg/kg。

3 结论

本方法采用基于EMR-lipid吸附剂的QuEChERS前处理方法，建立了水产配合饲料中4种黄曲霉毒素的LC-MS/MS测定方法。通过基质标准曲线校准，外标法定量完成了88批次水产配合饲料样品的黄曲霉毒素检测。相比基于免疫亲和柱或者多功能净化小柱的前处理方法，本方法前处理成本低廉、简便快捷，适用于现有标准的要求，可用于水产配合饲料中4种黄曲霉毒素的筛查检测与风险评估工作。

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Simultaneousdeterminationoffouraflatoxinsinaquaticcompoundfeedbyliquidchromatography-tandemmassspectrometrycombinedwithmodifiedQuEChERSmethod

LI Shiyan, KE Qingqing, WANG Dingnan, ZHOU Fan, BEI Yijiang, ZHENG Chongying,WANG Yang*

(Aquatic Products Quality Inspection Center of Zhejiang Province， Hangzhou 310023，China)

An analytical method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for four common aflatoxins in aquatic compound feed is established by improved QuEChERS method. The homogenized sample is dispersed by aqueous phase matrix, and then the analytes is extracted by acidic acetonitrile. The extract acquired is degreasedby enhanced matrix removal (EMR-lipid) material. After the process of salting-out, PSA, NH2, C18and MgSO4adsorbent is further purified and concentrated Then the analytes is detected and analyzed by LC-MS/MS.The linear ranges of the analytes are acceptable within the linearity range, and the limits of detection (LOD) both are 1.0 μg/kg. At the different spiked levels (n=6), the average recoveries are from 84.6% to 104% and the relative standard deviations (RSD) ranges from 3.5% to 11% in the compound feed. The proposed method is easy for pretreatment with high sensitivity and accuracy and also inexpensive, and efficient,which can assure the determination of four aflatoxins in aquatic compound feed is accurately detected.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017,7(5):25-32]

liquid chromatography-tandem mass spectrometry； aflatoxins； aquatic feed； EMR-lipid； QuEChERS

WANG Yang,wangyangruanfeng@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.004

S94

A

2095-1833(2017)05-0025-08

2017-05-22；接收日期2017-07-24

浙江省公益技术研究项目 (2015C32029)；浙江省“十三五”水产新品种重大科技专项子课题(2016C02055-5-8-2)

李诗言(1987-)，男，硕士，工程师，研究方向为水产品质量与安全，jimmyuu1987@163.com

王扬，教授级高级工程师，研究方向为水产品质量与安全，wangyangruanfeng@163.com