氯胺酮相关性膀胱炎大鼠逼尿肌热休克蛋白27的表达及其意义

林 黎， 王智超， 朱保平

(武汉市第一医院 急诊医学科， 武汉 430022)

氯胺酮相关性膀胱炎大鼠逼尿肌热休克蛋白27的表达及其意义

林 黎， 王智超， 朱保平*

(武汉市第一医院 急诊医学科， 武汉 430022)

研究热休克蛋白27(HSP27)在氯胺酮诱导膀胱炎大鼠逼尿肌中的表达及临床意义.基于氯胺酮腹腔内注射诱导大鼠膀胱炎模型，选择不同时间通过尿流动力学检测膀胱收缩功能，收集大鼠膀胱组织，常规病理染色观察膀胱粘膜及逼尿肌结构，免疫组化法检测HSP27在逼尿肌中的表达水平.实验后观察结果表明，同对照组相比，实验组尿动力学表现为膀胱收缩频率显著增加及初感膀胱容量明显减小；对照组膀胱组织无明显病理及免疫表达变化，而实验组可观察到不同程度膀胱粘膜充血，炎症细胞浸润，HSP27表达水平的上升，且HSP27表达水平与诱导时间呈正相关.实验结果表明HSP27的表达水平可能与氯胺酮膀胱炎的逼尿肌收缩活动程度相关.

氯胺酮； 热休克蛋白27； 大鼠

近年来，一种名为K粉(street ketamine)的新型毒品多见于夜店及年轻人派对上，其主要成分为氯胺酮(ketamine).研究发现氯胺酮长期大量滥用后会产生许多神经，心血管的不良反应，在随后的临床报道中又发现其对于泌尿系统有着严重的损害作用.近年来氯胺酮相关性泌尿系损害逐渐被人们所重视，并且进行了许多动物模型及流行病学研究[1].而在泌尿系统损害中，尤其以膀胱逼尿肌的损害及其相关症状较为常见和突出[2].王朝阳等[3]总结治疗的26名患者表明氯胺酮依赖者实际滥用超过1 a，大约40%会出现下尿路症状(LUTS)，包括尿频尿急尿痛，排尿困难，会阴或耻骨上疼痛，急迫性尿失禁，甚至出现肉眼血尿.而滥用剂量超过5 g/d，则出现下尿路症状比例升高为100%.滥用时间更长者，可进一步出现实质性器官损害，包括不可逆性膀胱挛缩，尿路纤维化，肾小球功能损伤.下尿路症状的突出表现与膀胱逼尿肌的病理性改变有着密切的联系，包括逼尿肌细胞的凋亡和收缩功能的改变等[4-5].在以往的研究中发现热休克蛋白27(HSP27)作为小热休克蛋白家族之一，广泛表达于各种平滑肌细胞中，对稳定肌细胞结构及调节平滑肌收缩中发挥了一定的作用[6].熊智勇等[7]通过实验发现对HSP27基因进行低表达干扰后能引起肌动蛋白收缩功能下降，其原因可能为骨架结构发生变化.闫书贤等[8]研究发现HSP27上调可能与尿路梗阻导致的逼尿肌收缩应激保护作用有一定的联系.本研究拟通过氯胺酮诱导膀胱炎大鼠模型，采用尿动力学检查、病理及免疫组织化学技术结合图像分析检测膀胱逼尿肌组织中热休克蛋白27的表达情况，进而希望能进一步揭示氯胺酮对于膀胱逼尿肌损伤的影响及相关机制，为临床治疗提供参考.

1 材料与方法

1.1 建立氯胺酮膀胱炎大鼠模型

实验材料为清洁级健康雌性SD大鼠40只，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，周龄12 w，体质量 200～250 g.随机分为4组，每组10只，A组为对照组，B组为8 w实验组，C组为9 w实验组，D组为10 w实验组.按照Meng方法[4]改良建立氯胺酮相关性膀胱炎大鼠模型，实验组与对照组分别于腹腔注射盐酸氯胺酮注射液(60 mg·kg-1·d-1)与容积生理盐水，持续注射8 w.盐酸氯胺酮注射液购自武汉久安药业有限公司，生理盐水取自武汉市第一医院药剂科.使用胶体金法检测大鼠尿中高浓度的氯胺酮及其代谢产物残留，证实模型诱导成功.建模成功后继续腹腔灌注氯胺酮，分别于第9 w、第10 w尿流动力学检测后处死大鼠，取新鲜膀胱组织，分同等2份，10%福尔马林溶液(取自武汉市第一医院病理科)固定后，制备石蜡切片，常规固定脱水透明，包埋切片，用于常规HE染色和免疫组化染色.

1.2 尿动力学检测

使用腹腔注射浅表麻醉大鼠，固定大鼠后将自制头端开有侧孔的1 mm输尿管导管经尿道口插入膀胱，后端通过软管接三通，三通管一端接微量泵，另一端接测压管连接换能器.检测指标包括：1) 初感膀胱容量：向膀胱内灌注生理盐水到开始排尿的最小容量；2) 膀胱排尿压：刚好促发并引起排尿的最大膀胱压.

1.3 常规病理染色

组织切片苏木精—伊红(HE)染色，光镜下观察膀胱尿路上皮及逼尿肌细胞的形态变化和炎性细胞浸润情况.

1.4 免疫组化染色(IHC staning)

采用SP法，SP试剂盒购自武汉市博士德生物工程有限公司，操作过程均按试剂盒说明进行，一抗为鼠抗人HSP27单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶(HRP).使用HSP27显著表达的阳性组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗为空白对照.HSP27的阳性表达物质弥漫性分布于胞质中，呈棕黄色颗粒状.在实验组玻片中随机选取10个视野，用酶联仪(武汉大学基础医学院租用)在450 nm波长测量随机视野吸光度，测得结果进行比较.

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件分析所得数据，以mean+SD形式表示相关计量资料数据，实验计量资料满足正态和方差齐性，多组间采用反差分析，两组间比较采用t检验.P< 0.05为有显著统计学差异.

2 结果

2.1 氯胺酮膀胱炎模型大鼠尿动力学改变

按1.1所述方法对氯胺酮处理组不同时间点的膀胱炎模型大鼠进行尿动力学检测，发现与对照组相比，初感排尿容量在8 w，9 w，10 w时均显著减少(图1)，具体数值如表1所示；同时，氯胺酮处理组大鼠的膀胱排尿压在上述3个时间点也显著减小(图2)，具体数值如表2所示.上述结果表明，氯胺酮处理对膀胱炎大鼠排尿具有促进作用.

图1 氯胺酮处理后膀胱炎模型大鼠不同时间初感排尿容量变化Fig.1 Change of bladder capacity of first sensation at different time after ketamine treatment

表1 氯胺酮处理后膀胱炎模型大鼠不同时间初感排尿容量数值Tab.1 Bladder capacity of first sensation at different time after ketamine treatment mL

注：数值为x±s形式，n=10，B、C、D三组中实验组相较于对照组均有P<0.05.

图2 氯胺酮处理后膀胱炎模型大鼠不同时间膀胱排尿压变化Fig.2 Change of vesical micturition pressure at different time after ketamine treatment

表2 氯胺酮处理后膀胱炎模型大鼠不同时间膀胱排尿压力值Tab.2 Change of vesical micturition pressure at different time after ketamine treatment mmH2O

注：数值为x±s形式，n=10，B、C、D三组中实验组相较于对照组均有P< 0.05.

2.2 氯胺酮处理后大鼠膀胱组织镜下病理改变

通过常规HE染色可见，对照组炎性细胞少量或基本正常，而建模成功后的氯胺酮性膀胱炎大鼠膀胱尿路上皮细胞层数明显减少，部分缺失，大量炎性细胞及淋巴细胞浸润，图中较为紫色深染的为多核细胞；大鼠膀胱粘膜层和肌层之间还可见纤维组织增生和胶原沉积(图3).

图3 膀胱炎模型大鼠第9 w膀胱组织HE染色结果(放大100倍)Fig.3 HE staining results of bladder tissue of 9 w rat model

2.3 膀胱组织HSP27表达检测(放大100倍)

对第10 w的4组大鼠膀胱组织进行免疫组化染色，检测其中HSP27的表达.结果发现，对照组A中，HSP几乎无明显表达，HSP阳性表达物质棕色颗粒极少可见；氯胺酮处理组中则均可见HSP棕色表达颗粒(图4).具体统计数值，表明实验组HSP27表达明显增高，棕色颗粒色度表达与吸光度数值呈正比(表3).上述结果显示HSP27表达水平同灌注氯胺酮时间有相关性.

图4 膀胱炎模型大鼠第10 w膀胱组织中HSP27的表达情况(放大100倍)Fig.4 HSP27 express in bladder tissue of 10 w rat model

表3 HSP27免疫组化染色结果统计值Tab.3 Statistical results of HSP27 expression level determined by IHC staining

注：数值为HSP27/β-actin，x±s形式，n=10，B、C、D三组中实验组相较于对照组均有P< 0.05.

3 讨论

氯胺酮于1962年由美国药剂师Calvinstevens首次以苯环已哌啶(N-1-pheny-cyclohexy-piperidine，PCP)的衍生物形式成功研制[9].氯胺酮作为非巴比妥类药物，在临床上主要作为麻醉药物使用.由于它有一定的致幻作用，故被某些娱乐场所作为致幻剂滥用.根据安丽娜等[10]对广州戒毒医院调查分析，首次吸食氯胺酮者年龄主要集中在19岁左右，其中25岁的青少年男性比例达到90%以上.蓝晓嫦等研究表明氯胺酮可导致吸食者体内多种性激素包括睾酮(TEST)、雌二醇(E2)等血清水平明显升高，故可提高性欲，在一定程度上增强性能力[11].氯胺酮在肝脏的首过效应比较明显，故滥用时吸食方式多以鼻吸，肌肉注射及静脉注射为主.相对于传统毒品，氯胺酮身体成瘾性较低，主要成瘾性表现为精神上的致幻及兴奋，除此以外还可引起心血管、神经及消化系统损害，近年来又发现还具有泌尿系损害副作用[2].2007年首次报道了由氯胺酮所导致的泌尿系损害症状[12]，即在吸食后出现尿频尿急血尿等类似间质性膀胱炎症状[9].随着相关病例及报道逐渐增多，氯胺酮相关性泌尿系损伤也被人们重视及关注.银佑乐等[13]研究显示在氯胺酮的长期作用下，可引起肾小球炎症细胞大量浸润，肾小管水肿及空泡样改变，多处小管坏死，最终可引起肾小球萎缩，甚至闭锁，同时肾间质中胶原纤维沉积，形成纤维条索.目前，尚未有明确证据反映氯胺酮引起泌尿系统损害的机制，但氯胺酮吸食者的尿液中可检测出高浓度的氯胺酮及代谢物，多数学者认为尿液中氯胺酮及其代谢物是引起损害的主要物质.这些物质可导致整个尿路上皮的慢性炎性改变，凋亡，使尿路上皮缺失、纤维化，从而进一步损害膀胱肌层，产生肌层的纤维化，引起结构破坏及功能丧失[9，14-15].而膀胱逼尿肌收缩功能的下降，纤维化增生将最终导致膀胱壁增厚，膀胱挛缩，容量减小，使膀胱失去正常的排尿功能.人热休克蛋白27由205 aa组成，于平滑肌细胞中广泛表达，以分子伴侣蛋白形式调节平滑肌收缩，对细胞生存具有重要影响[16-18].HSP27常以大分子复合物存在于平滑肌中，包括单体和多聚体[19]. BATTS[20]等发现膀胱组织中有热休克蛋白家族成员HSP20表达.而XIONG[21]，闫书贤[8]等报道在急性尿潴留大鼠模型膀胱逼尿肌中，HSP27和HSP20显著表达，并且HSP的表达变化与大鼠膀胱收缩功能变化相关.本实验通过腹腔注射建立氯胺酮相关性膀胱损害大鼠模型，以注射后8周检测到大鼠尿液中含有氯胺酮及代谢物为成功建立模型的标志[22-23].利用大鼠模型研究由氯胺酮导致的膀胱尿流动力学改变及病理学变化，以及HSP27在膀胱逼尿肌组织中的表达变化.结果显示较对照组大鼠腹腔注射氯胺酮均后出现初感排尿容量的下降、排尿前膀胱压的增加及储尿期收缩频率的增加，这些尿流动力学表现同人类吸食氯胺酮后引起的下尿路症状类似.同时通过对膀胱组织不同时段HSP27检测，发现注射氯胺酮后大鼠膀胱逼尿肌中HSP27表达水平有随时间升高的趋势，同尿流动力学中膀胱收缩性呈正相关.因此推测，氯胺酮成功诱导膀胱炎后可引起急性期膀胱逼尿肌收缩频率增加，肌细胞中的HSP27水平相应上升，而且呈时间相关性.HSP27水平一定程度的上调可能早期对于逼尿肌有一定的保护及代偿作用，但同时也可以作为逼尿肌功能受到损害的表现，进一步研究HSP27上调水平的曲线，有助于了解逼尿肌功能失代偿的机制，为临床治疗提供新的参考.

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Expressionsandsignificancesofheatshockprotein27indetrusortissueofratswithketamine-associatedcystitis

LIN Li， WANG Zhichao， ZHU Baoping

(Wuhan NO.1 Hospital， Wuhan 430022)

To investigate the expression of heat shock protein 27(HSP27) in detrusor tissue of rats with ketamine and clinical significance. Rats were injected intraperitoneal with ketamine to establish the cystitis model. Through urodynamic detection the function of bladder contraction was studied， and then urinary bladders of the rats were harvested for routine pathological staining to analysis bladder mucosa and detrusor structure. HSP27 expression level in detrusor tissue at different time point was detected by immunohistochemical (IHC) staining. In comparison to the control group， urodynamic change of ketamine treated group showed significantly increased frequency of bladder contraction and reduced bladder capacity of first sensation; there is no significant change on pathological and immune expression in the control group， while it was observed in the experimental group with different degree of bladder mucosal hyperemia， inflammatory cells infiltration and elevated HSP27 expression levels; additionally， HSP27 expression level was positively correlated with the induction time. These results suggested that the expression levels of HSP27 might have a correlation with the degree of detrusor contraction activities of ketamine-associated cystitis．

ketamine; heat shock protein 27; rats

R694+.3

A

2017-05-21.

湖北省自然科学基金项目(2012FFA094).

*通讯联系人. E-mail: 130719170@126.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.05.015

1000-1190(2017)05-0646-05