Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异

陈珊珊 周剑峰 廖勇 李海涛 王瑞丽 巴根 吕雪莲 杨蓉娅

100700北京，解放军陆军总医院皮肤科

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异

陈珊珊 周剑峰 廖勇 李海涛 王瑞丽 巴根 吕雪莲 杨蓉娅

100700北京，解放军陆军总医院皮肤科

目的研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异，探讨其在菌丝生长过程中的作用。方法分别培养阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相，提取两组的总RNA，采用荧光定量PCR方法测定两组中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相对表达量。结果酵母相菌丝生成率（0.40%±0.53%）显著低于菌丝相（99.33%±0.57%，t=13.93，P＜0.05）。实时荧光定量PCR显示，以酵母相为对照组，将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1，则菌丝相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相对表达量分别为25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，与酵母相比较，差异有统计学意义（t值分别为3.81、3.51、3.90，均P＜0.05）。结论Ras1、Rac1、Rho1基因可能参与了阿萨希毛孢子菌菌丝的生长过程。

毛孢子菌属；单体GTP结合蛋白质类；阿萨希毛孢子菌；Ras1；Rac1；Rho1；酵母相；菌丝相

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是一种条件致病真菌，在细胞形态上可表现为酵母样芽生孢子、关节孢子、真菌丝和假菌丝。真菌的形态转换在其生长、播散感染中发挥重要作用，其中酵母相与菌丝相间的相互转换关系复杂，而这种转换对其环境适应和毒力都有重要影响［1-3］。Ras超家族蛋白是最早发现的小G蛋白，主要包括Ras、Rab、Arf、Rho和Ran 5个亚家族，具有GTP酶活性，在形态转换的调控通路中起重要作用。Rac1和Rho1作为Rho家族蛋白的重要成员，在真菌极性生长中发挥重要作用［4］。有研究显示［5］，Rho家族蛋白成员Cdc42在T.asahii的菌丝相中的表达明显高于酵母相，很可能参与T.asahii菌丝的生长。本研究采用荧光定量PCR检测Ras1、Rac1、Rho1 mRNA在T.asahii酵母相和菌丝相中的表达水平，以了解Ras1、Rac1、Rho1基因与T.asahii菌丝形成的关系。

一、材料和方法

1.实验菌株、试剂和仪器：T.asahii标准株CBS2479，购自荷兰皇家艺术与科学学院真菌多样性研究中心（CBSKNAW）。酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖）、玉米培养基（北京奥博星生物技术有限公司），RPMI1640培养基（美国Gibco公司），Trizol试剂（美国Sigma公司），cDNA第1链合成试剂盒（美国Invitrogen公司），荧光定量PCR检测试剂盒（美国ABI公司），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HIQ-E双层空气恒温振荡器（北京东联哈尔仪器制造有限公司），NanoDrop2000分光光度计（美国Thermo Scientific公司），LightCyler 480荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

2.T.asahii酵母相、菌丝相的培养及观察：将YPD斜面生长48 h的T.asahii标准株CBS2479接种于YPD液体培养基，密度调整为5.0×106/ml，置摇床25℃振荡培养24 h，1 500×g离心5 min，弃上清液，以无菌去离子水洗涤并调整细胞密度至5.0×108/ml。取200 μl高浓度菌液，加入4.8 ml无菌水稀释，分别取1 ml稀释液平铺于5个直径为90 mm玉米固体培养基上，35℃培养5 d，以获得酵母相；取200 μl高浓度菌液接种于1个50 ml RPMI1640液体培养基，37℃振荡培养24 h，以获得菌丝相［5］。

从玉米培养基上刮取适量菌落，从液体培养基中取10 μl菌悬液，均于光镜下（×200），在血细胞计数板上计数100个细胞中形成菌丝的细胞数，得出百分数。重复试验3次。以菌丝长度为孢子直径3倍以上者作为菌丝计数［6］。

3.T.asahiiRNA提取及反转录：收集菌悬液，离心，弃上清液，用去离子水重新悬浮，洗涤2遍，弃上清液，置于研钵中加入适量液氮研磨，在液氮未完全挥发前加入1 ml Trizol RNA提取试剂，按Trizol法提取总RNA，干燥后加入DEPC水20 μl溶解。用分光光度计测量提取的总RNA浓度和纯度，并电泳测量RNA完整性。取纯度和完整性较好的RNA进行反转录，每个样品取总RNA 2 μg，采用反转录试剂盒按说明书进行反转录反应以合成第1链cDNA，反应条件：42℃20 min、95℃3 min，冰上冷却后置于-20℃贮存备用。

4.T.asahiiRas1、Rac1、Rho1基因荧光定量PCR反应：采用荧光定量PCR检测试剂盒按照说明书进行操作。配置PCR扩增体系（总体积20 μl）：1× Power SYBRgreen PCR Master Mix 10 μl、ddH2O 8 μl、待扩增基因的上下游引物各0.5 μl、模板cDNA 1 μl。扩增反应在Roche 480型荧光定量PCR仪中进行，反应条件：预变性95℃10 min；变性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min，40个循环；60～ 95℃进行熔解曲线分析，每10 s升高1℃。基因的上、下游引物和退火温度见表1，18S RNA为内参照。每个样品均设置3个复管，重复试验3次。分别测定酵母相和菌丝相中Ras1、Rac1、Rho1基因及内参基因18S RNA的Ct值，试验结果取其均值，按照2-△△Ct相对定量公式计算菌丝相相对于酵母相的各基因mRNA转录水平，其中△△Ct=（菌丝相目的基因平均Ct值-菌丝相内参基因平均Ct值）-（酵母相目的基因平均Ct值-酵母相内参基因平均Ct值）。

5.统计学分析：应用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.T.asahii酵母相和菌丝相的形态观察及菌丝生成率比较：T.asahii标准株于玉米培养基35℃培养5 d，镜下观察可见大量关节孢子及芽生孢子，基本为酵母相，菌丝生成率为0.40%±0.53%；而于RPMI1640培养基37℃培养24 h，镜下观察可见大量细长菌丝，可见分枝，菌丝间可相互缠绕，基本为菌丝相，菌丝生成率为99.33%±0.57%，两者菌丝生成率差异有统计学意义（t=13.93，P＜0.05）。

2.Ras1、Rac1、Rho1基因在酵母相和菌丝相中的表达：实时荧光定量PCR显示，目的基因和内参基因的熔解曲线峰均为单一峰形且峰形锐利，未见其他峰值。扩增曲线均光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完整，符合定量检测要求。相对定量分析显示，以酵母相为对照组，将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1，则菌丝相mRNA相对表达量分别为25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50，与酵母相比较，差异均有统计学意义（t值分别为3.81、3.51、3.90，P＜ 0.05）。

表1 各基因上下游引物及退火温度

三、讨论

真菌形态转换的调控通路和相关基因复杂，而Ras超家族蛋白则是其中的重要成员，其中Ras1基因在真菌生长过程中发挥重要作用。例如在酿酒酵母中，Ras1同源蛋白通过cAMP/PKA、MAPK信号转导通路及Rho蛋白系统，参与细胞周期、假菌丝生长和压力应答力等多项细胞进程［7-8］，与其在白念珠菌中的作用类似。在白念珠菌中，Ras1蛋白通过cAMP/PKA通路来调控酵母形态、压力应答、细胞黏附和交配［9］。白念珠菌不仅能形成酵母和假菌丝的形态，还能生成真菌丝，而这种酵母-菌丝的菌相转换也是由Ras1蛋白通过cAMP/PKA和MAPK信号转导通路调节［9］。在总状毛霉的萌芽和菌丝生长阶段，Ras1都有大量表达，且活性Ras1能增高萌芽期的生长率［10］。此外，Rac1和Rho1是Rho家族蛋白的重要成员，在真菌极性生长过程中也发挥重要作用。Hurtado等［11］研究发现，在解脂亚罗酵母中Rac1基因从酵母相转化为菌丝相时表达量显著提高。在玉蜀黍黑粉菌和麦角菌中，Rac1的缺失会破坏菌丝的极性生长［12-13］。在裂殖酵母、粗糙脉孢霉、白念珠菌、构巢曲霉等真菌细胞中，Rho1与细胞极性生长、细胞壁合成等活动直接有关［14-19］。Harris［20］发现，在黑曲霉中，Rho1突变株可影响细胞出芽生长。本研究中Ras1、Rac1、Rho1基因在T.asahii酵母相和菌丝相均有表达，但在菌丝相中的mRNA相对表达量均显著高于酵母相，且差异有统计学意义，提示Ras1、Rac1、Rho1基因并非菌丝特异基因，但参与了细胞极性生长和酵母相转换成菌丝相的生理过程。

综上，Ras家族蛋白的代表成员Ras1、Rac1、Rho1与T.asahii生长有密切联系，在不同真菌形态转换中起到了很大作用。但这还需要进一步的实验研究来验证，如基因敲除、基因沉默等。这些基因在T.asahii菌丝生长过程中的具体调控机制及与致病性之间的关系也需深入的探讨。

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中国麻风史料陈列馆、中国医学科学院皮肤病研究所史料陈列馆征集文物和史料启事

为真实记载中国麻风防治的发展历程，全方位展现中国医学科学院皮肤病医院、研究所（简称院所）60余载的历史变革和文化积淀，传承和发扬老一辈无私奉献的精神，院所决定筹建中国麻风史料陈列馆、院所史料陈列馆。即日起，面向社会各界广泛征集具有历史价值的文物和史料。

一、征集范围

1.反映院所各历史时期发展沿革、重大活动、科研成就、领导关怀及院所职工参加国内外重大活动等方面的重要文献、题词、图片、新闻报道、手稿、徽标、纪念册、音像制品、奖状、证书等。

2.国家领导人、社会知名贤达及重要外宾、杰出校友来院所参观、考察、访问或演讲时的题词、图片、新闻报道、音像制品等。

3.各类皮肤性病、麻风防治的图片、图表及文字说明，医、教、研、防、管等领域工作中使用过的办公用品、仪器设备、书籍教案、教学工具等实物。

4.反映中国麻风防治历程及成就，麻风受累者的医疗及生活状况等有历史价值的文物和史料。

二、征集方式及要求

1.文物和史料的征集采用捐赠、代管、借用等方式。

2.所有文物和史料请提供文字说明，含来源、史料载体、形成时间及其所涉及的人物、事件等要素。

3.文物和史料的征集欢迎直接送达；亦可通过电子传送、信函邮寄、预约拜访、登门征集等途径进行。

4.征集的文物和史料，均登记入册；一经采用，除在史馆陈列时标注捐赠者的姓名外，将授赠荣誉证书。

5.征集时间：长期征集。

三、联系方式

联系人：210042，南京玄武区蒋王庙街12号，中国医学科学院皮肤病研究所中心办公室（科研楼415室）诸萍，电话：025-85478032，传真：025-85424903，Email：zhup@ncstdlc.org。

《中国皮肤性病学书目提要及著者传略》征文及研修班招生

为了系统总结我国皮肤性病学文献及介绍做出重要贡献的著者，廖万清院士、禤国维国医大师领衔编辑《中国皮肤性病学书目提要及著者传略》。凡为该书提供书目及著者传略者、向筹建的中国皮肤科博物馆赠送文物者，可获赠《中国皮肤科学史》（600元）1册。

为推广我国政策规定的外用中药临方调剂、中医中药疗法，2017年继续举办全国皮肤美容化妆品制剂研修班，马振友、李斌传授实用处方，示教实习，学会为止。刘巧、刘红霞等名中医传授示教火疗、火针、脐疗、薰蒸、烟薰、熨烙、鲜药、刺络拔罐、太乙神针等实用疗法，学员互教互学。报名注册者获赠《皮肤美容化妆品制剂手册》和《皮肤病中医方剂制剂手册》各1册。赠送临方调配乳膏基质及苍龙岭牌等皮肤外用产品试用。对索取征文及招生信息和获取试用药品者，来函必复、必赠。

陕西马振友药业有限公司，手机/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

Differences in expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases of Trichosporon asahii

Chen Shanshan,Zhou Jianfeng,Liao Yong,Li Haitao,Wang Ruili,Ba Gen,Lyu Xuelian,Yang Rongya
Department of Dermatology,General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

s:Yang Rongya,Email:yangrya@sina.com;Lyu Xuelian,Email:mycoses@gmail.com

ObjectiveTo investigate differences in the expression of Ras1,Rac1 and Rho1 genes between yeast and hyphal phases ofTrichosporon asahii（T.asahii）,and to explore their roles in the formation of hyphae.MethodsThe yeast phase and hyphal phase ofT.asahiiwere cultured and served as yeast phase group and hyphal phase group respectively.Total RNA was extracted from the 2 groups,and real-time fluorescence-based quantitative PCR（RT-PCR）was performed to measure the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1.ResultsThe hyphal formation rate was significantly lower in the yeast phase group than in the hyphal phase group（0.40% ±0.53%vs.99.33% ±0.57%,t=13.93,P＜0.05）.When the mRNA expression of Ras1,Rac1 and Rho1 in the yeast phase group was all set as 1,that in the hyphal phase group was 25.17±10.99,16.81±7.80,42.61±18.50,respectively,with significant differences between the two groups in the three parameters（t=3.81,3.51,3.90,respectively,allP＜ 0.05）.ConclusionRas1,Rac1 and Rho1 genes may participate in the regulation of hyphal formation inT.asahii.

Trichosporon;Monomeric GTP-binding proteins;Trichosporon asahii;Ras1;Rac1;Rho1;Yeast phase;Hyphal phase

杨蓉娅，Email：yangrya@sina.com；吕雪莲，Email：mycoses@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.013

国家自然科学基金（81471928、81571972）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81471928,81571972）

2016-05-11）

（本文编辑：周良佳 颜艳）