miR-152在声门上型喉癌中的表达及临床病理关系

迟 慧，宋 岩，那 迪，白伟良

miR-152在声门上型喉癌中的表达及临床病理关系

迟 慧1，宋 岩1，那 迪2，白伟良1

目的探讨并分析miR-152在声门上型喉癌组织中的表达情况，为进一步研究miR-152用于治疗靶向药物、评估预后提供参考依据。方法采用Real-time PCR法检测83例患有声门上型喉癌患者癌组织中miR-152的表达，并将miR-152的表达数据与临床病理数据进行对比分析。最后，通过MTT方法对比转染了miR-152模拟物组和阴性对照组的Hep-2细胞系受抑制情况。结果miR-152在声门上型喉癌组织中显著低表达(t=12.65，P<0.001)，并且其低表达与声门上型喉癌的T分期(χ2=26.88，P<0.001)和N分期(Z=-3.56，P<0.001)相关。miR-152可抑制Hep-2细胞增殖。结论miR-152可能作为声门上型喉癌预后的新靶点。

声门上型喉癌；MiR-152；Hep-2细胞系；临床相关性

0 引言

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第6大常见癌症。每年有160万新发病例，33.3万死于鳞状细胞癌，其中有一半发生在口腔(口腔鳞状细胞癌)[1]。每年全世界有500 000名患者被诊断为头颈鳞状细胞癌。在发达国家中有95%的喉癌为鳞状细胞癌，占恶性肿瘤的5%，严重威胁着人类的健康。喉癌的发生和发展涉及许多基因和信号通路。喉癌的发病机制始终没有被阐释清楚。

miRNAs是大小约为19～23 nt的非编码RNA，在进化过程中高度保守，能够与靶基因结合，在转录后水平调节基因的表达水平。其被RNA多聚酶Ⅱ转录为pri-miRNA，再被RNA酶ⅢDrosha加工为70～100个核苷酸的pre-miRNA[2]。越来越多的证据表明，miRNA的调控失调与多种疾病相关。目前，研究表明，miRNA在肿瘤的发展中起重要的作用。然而，miRNA在喉癌中的调控机制仍然是未知的。

最近的研究显示，一些miRNA与喉癌相关。Su等[3]发现，在非小细胞肺癌中miR-152的恢复显著抑制了增殖、克隆形成、转移和侵袭[4]。Huang等[5]认为，miR-152可能抑制肝癌的增殖。Zhu等[6]认为，miR-152可以抑制PCa细胞的迁移和侵袭。Zheng等[7]发现，在体内侵袭实验中，miR-15b和miR-152可以显著降低9L细胞的侵袭能力。Woo等[8]在体外实验中发现，miR-128 和miR-152在卵巢癌中下调了CSF-1 mRNA和蛋白的表达，导致细胞运动性和黏附性降低。

本研究探讨并分析miR-152在声门上型喉癌组织中的表达情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料 本研究经中国医科大学伦理委员会批准。所有83例样本均来自我院2008年5月至2013年8月确诊为声门上型喉癌的患者。所有患者均未发生远端转移，术前没有接受过放疗和化疗，接受喉全切除术。对照组黏膜样本取自同一患者肿瘤组织边缘2 cm处。术后新鲜标本立刻进行液氮冷冻，于-80 ℃保存。相关资料(年龄、性别、肿瘤T分期、N分期、患者肿瘤不同分级)均来自我院患者资料信息库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和miRNA mimics转染 人喉癌细胞系Hep-2购自武汉大学保藏中心细胞库。采用RPMI 1640培养基(Gibco)，添加10%血清(Hyclone)，100 U/mL青链双抗(Life Technologies)，5% CO2、37 ℃下培养。所有实验均采用对数生长期细胞。在Opti MEM (Invitrogen)培养基中使用lipo2000介导Hep-2细胞进行miR-152 mimic和miRNA mimics 阴性对照(Invitrogen，CA，USA)的转染。

1.2.2 Real-time PCR 采用Rotor-gene 6000系统(QIAGEN，Valencia，CA)，Universal qPCR通用试剂盒。25 μL PCR体系中包含2 μL反转录产物，12.5 μL SYBR Green supermix，8.5 μL 无酶水，1 μL正向引物和1 μL反向引物。本反应在36孔板上进行，反应条件为94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共计45个循环。使用U6RNA作为内参去标准化miR-152的表达。阈值周期数据采用默认。对比癌组织和癌旁组织中miRNA的表达水平，并采用2-ΔΔCt的方法进行计算[9]。miR-152的相对表达率已经根据内参基因进行了归一化处理，并于癌旁组织做对比。引物序列见表1。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 采用MTT法检测细胞增殖的活力。转染24 h后，将转有miR-152 mimics的Hep-2细胞和转有NC的Hep-2细胞铺96孔板，分别孵育24、48、96 h。之后，加入20 μL MTT (5 mg/mL) 37 ℃孵育4 h，室温下加入150 μL DMSO以溶解结晶。使用MK3型酶标仪(Thermo，Waltham，MA，USA)测490 nm下的吸光度值。所有实验重复3次，并与生长抑制率做对比。

1.3 统计学分析 采用公式2-ΔΔCt计算癌和癌旁组织中的相对表达量(ΔCt=CtmiR-152-CtU6；ΔΔCt=ΔCtcancer-ΔCtcontrol)。生长抑制率采用如下公式计算：(AC-AT)/AC×100% (AC=对照组吸收值，AT=实验组吸收值)[10]。

2 结果

2.1 喉癌中miR-152的表达 对比分析83例进行喉全切除术患者的成对样本中miR-152的表达。对比分析癌组织和黏膜组织的ΔCt值。癌组织中ΔCt值为1.92±1.25，对照组为-0.19±1.62。其中74例(89%)与对照组相比为miR-152低表达(t=12.65，P<0.001)。见图1。

2.2 miR-152的表达与临床病理因素的关系 采用非参数测定法分析miR-152和临床病理参数之间的关系(包括性别、年龄、T分期、N分期和细胞分化程度)。miR-152的水平在性别、年龄和肿瘤位置之间没有显著差异。miR-152低表达趋向于促进了声门上型喉癌的T分期和N分期(χ2=26.88，P<0.001；Z=-3.56，P<0.001)。具体见表2。

表1 用于RT-PCR扩增的miR-152的引物序列

图1 声门上型喉癌患者miR-152表达情况

表2 miR-152的表达量与声门上型喉癌患者临床病理因素的关系

2.3 miR-152对Hep-2细胞增殖的影响 为了评价转染miR-152前后Hep-2细胞的细胞活性，我们对比了转染miR-152模拟物的Hep-2细胞和转染miR-152阴性对照模拟物Hep-2细胞的生长情况。24、48、96 h后，转染模拟物组的抑制率为25%、27%、42.7%，转染阴性对照组的抑制率为8.3%、6.0%、7.3%。如图2所示，转染模拟物组的抑制率显著提高。

图2 MTT检测转染miR-152后Hep-2细胞生长抑制率

3 讨论

MicroRNA是一群小的高度保守非编码单链RNA家族，通过转录抑制或结合到转录体的3′-UTR区靶点，降解mRNA，发挥调控基因表达的作用，在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。miRNA在病理生理过程中具有关键的作用，调控许多生理进程，包括细胞增殖、分化、凋亡、转移和致瘤性转化[11]。成熟miR-152序列为54︱5′-UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG-3′︱75，许多肿瘤和正常组织都表达miR-152，但其在发生、发展和肿瘤形成等不同时期呈现差异表达。miR-152在消化道系统[12-13]和生殖系统肿瘤[14]细胞和组织中表达下降，并对肿瘤细胞生长、增殖、血管新生等发挥重要的生物学功能，起抑癌基因作用，并在一定程度上与疾病的分期、预后相关。Azizi等[15]通过对比1型糖尿病患者和年龄相对应的正常人发现，有12个上调的miRNA，其中包括miR-152。

miR-152在许多组织中表达降低，提示其可以作为肿瘤抑制miRNA。Huang等[16]研究显示，与附近的非癌性肝组织相比，miR-152在HBV相关的HCC组织中的表达下降。有报道，在胃肠道癌中，miR-148a和miR-152在癌组织和癌细胞系表达下调，且miR-152的低表达与增加的肿瘤大小和T分期的进展相关[17-18]。本研究中，miR-152低表达与声门上喉癌的T分期和N分期相关，提示miR-152可能成为潜在的生物标记物。

MTT试验结果显示，miR-152模拟物转染后的Hep-2细胞增殖呈时间依赖性降低，提示 miR-152能够抑制Hep-2细胞增长。在83例患者中，74例患者肿瘤组织中miR-152表达降低。在声门上型喉癌中miR-152 表达显著降低 (t=12.65，P<0.001)。

声门上型喉癌中miR-152表达结果显示，miR-152低表达与较差的T分期和N分期有显著的关联。T3、T4期声门上型喉癌组织中miR-152表达较T2期明显降低(χ2=26.88，P<0.001)。本研究首次发现，miR-152的低表达与N分期相关(Z=-3.56，P<0.001)。本研究没有包括T1期的声门上型喉癌，所有T1期的声门上型喉癌均采用激光治疗。

本文中，83例患者均被诊断为声门上型喉癌。根据病变的部位，喉癌分为声门上、声门、声门下3种类型。因为在声门区域缺少淋巴，喉癌不倾向于淋巴结转移。为了使结果客观准确，我们选择的所有病例均经病理确诊为声门上型喉癌。

在声门上型喉癌中miR-152的表达与细胞分化没有显著关系。通过样本偏差来解释所得到的结果，有60例被诊断为高度分化(60/83)，低分化的病例所占比例很小。因此，结果或许有偏差，期望以后通过扩大样本量来解决此问题。

本文按照N分期将所有病例分为2组。组1包括所有处于N0期的病例；组2包括所有N1、N2、N3、N4期的病例。考虑到样本量较小，我们没有将N1～N4继续细分。尽管所有病例仅被分成2组，依然可以显示miR-152和淋巴结转移之间的相关性。

T分期和N分期较差是生存率的独立预后因素，表明miR-152表达在诊断方面可能作为生物学标志物；在治疗方面，可能会成为一种药物用于靶向治疗；在预后评估方面，可能为临床评价及判断预后提供参考依据。

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ExpressionofmiR-152anditsclinicalpathologicalsignificanceinsupragalotticlaryngealcarcinoma

CHI Hui1,SONG Yan1,NA Di2,BAI Wei-liang1

(1.Department of Otorhinolaryngology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo discuss and analyze the expression of miR-152 in tissues of patients with supragalottic laryngeal carcinoma,and provide reference data for further study of the function of miR-152 in tumor target medicine and prediction of the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.MethodsThe expression of miR-152 was detected in tissues of 83 patients with supragalottic laryngeal carcinoma by Real-time PCR,and the relationship between the expression of miR-152 and clinicopathological parameters was analyzed.The inhibition of the Hep-2 cells which was transfected with miR-152 mimics and transfected with mimics negative control by MTT was compared.ResultsmiR-152 was significantly low-expressed in supragalottic laryngeal carcinoma (t=12.65,P<0.001).Moreover,low-expression of miR-152 was correlated with stage pT (χ2=26.88,P<0.001) and stage pN (Z=-3.56,P<0.001) in supragalottic laryngeal carcinoma.MiR-152 could inhibit the cell proliferation in Hep-2 cells.ConclusionMiR-152 may act as a new tumor target to predict the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.

Supragalottic laryngeal carcinoma;miR-152;Hep-2 cell line;Clinical relevance

2017-01-28

1.中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004;2.中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2015586)；沈阳市科学计划项目资助(F13-220-9-21)；辽宁省科学事业公益研究基金(2013001010)；辽宁省自然科学基金(20170541043)

10.14053/j.cnki.ppcr.201710008