补气生肌方促进糖尿病性难愈创面血管新生和创面修复愈合的作用机制

陈玉姣，白晓苏，曾丽红

补气生肌方促进糖尿病性难愈创面血管新生和创面修复愈合的作用机制

陈玉姣a，白晓苏b，曾丽红c

目的观察补气生肌方对糖尿病大鼠难愈创面的血管生成和促进血管生成的因子表达的影响。方法选取48只雄性SD大鼠，经高脂高糖饲料喂养1周后，按35 mg/kg腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液，糖尿病模型造模成功后制作创面模型，随机分为观察组(24只)和对照组(24只)，其中观察组局部应用补气生肌中药涂抹，对照组应用凡士林涂抹，均为每日1次。采用免疫荧光法检测血管生成情况，PCR检测创面组织中血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)的基因表达。结果观察组第3天、第7天、第14天的创面愈合率高于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示，第7天观察组、对照组的创面组织CD-34阳性细胞数分别为34.39%±3.46%和12.42%±1.53%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。PCR检测结果显示，在第3天、第7天、第14天，观察组创面组织VEGF-A、bFGF mRNA表达高于对照组(P<0.05)。结论补气生肌方在治疗糖尿病难愈性创面时，可上调VEGF-A和bFGF基因表达，促进创面组织血管生成，有利于难愈性创面的愈合和重建。

补气生肌方；糖尿病；创面；血管

0 引言

糖尿病性难愈创面是严重的糖尿病并发症之一，由于创面愈合紊乱，易形成顽固性溃疡[1-2]。目前，中医或者西医治疗糖尿病性难愈创面均具有一定的局限，如何更有效地促进创面愈合是临床工作中的一大难题。笔者在长期临床实践中发现，糖尿病创面难愈的原因在于气虚血瘀，治疗上应以益气化瘀、去腐生肌敛疮为主。经过多年临床经验，笔者总结出补气生肌方，并取得了较好的临床疗效。为了进一步明确补气生肌方促进糖尿病性难愈创面血管新生和创面修复愈合的作用机制，本研究拟观察其在糖尿病大鼠创面愈合过程中对血管生成和促进血管生成的因子(VEGF、bFGF)表达的影响，为补气生肌方在糖尿病性难愈创面的治疗奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠(中山大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK粤2014-0011)，二级、清洁，48只，体重(240±20) g。补气生肌中药膏及基质由本院提供；cDNA Synthesis Kit和SybrGreen PCR Master Mix试剂盒(ABI公司)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；PCR相关试剂购于北京康为世纪生物科技有限公司；鼠抗人CD34抗体(Abcam公司)；FITC标记二抗(北京中杉金桥生物技术公司)；Vii ATM7型Real time RCR扩增仪(Applied Biosystems公司)；Elx800-UV酶标仪(Bio-tek公司)；IX-71荧光显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2 动物模型的建立 参考文献方法[3]，大鼠经高脂高糖饲料喂养1周后，在空腹3 h状态下，称重。按30 mg/kg腹腔注射1%STZ溶液。3、7 d后测血糖，随机血糖持续高于16.7 mmol/L即认定糖尿病大鼠模型成功。造模成功的大鼠继续喂养2周后，于麻醉状态下采用8%硫化钠对大鼠背部脊柱附近腰背部进行脱毛，用角膜环钻剪去一块直径约为8 mm的圆形全层皮肤，制作创面模型。采用随机数字表法将48只模型大鼠随机分为观察组(24只)和对照组(24只)，其中观察组局部应用补气生肌中药涂抹，以局部涂满为度，1次/d；对照组局部应用基质膏(凡士林)涂抹，以局部涂满为度，1次/d。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 动物处理及留取标本 各组在换药后第3、7、14天分别处死8只大鼠，以创面为中心，距创面边缘向外2 mm切取组织。将组织分成两半，一半放置于液氮中，用于PCR试验；另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理标本制作。

1.3.2 血糖监测 分别于治疗前和创面给药治疗后第3、7、14天测定各组大鼠空腹血糖，断尾取血1 mL，上全自动血糖仪检测。

1.3.3 创面愈合率的测定 分别于创面给药治疗后第3、7、14天对大鼠的创面进行拍照，计算创面愈合率。

1.3.4 免疫荧光检测 组织块标本固定于4%多聚甲醛，常规石蜡包埋切片，抗原修复，封闭，滴加鼠抗人CD31抗体(工作浓度1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗2次，加入FITC标记的二抗(工作浓度1∶100)，避光孵育30 min，进行DAPI复染5 min，PBS冲洗多余的DAPI，封片，轻覆上盖玻片，免疫荧光显微镜下观察并采集图片，应用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性染色区域荧光的强度并量化。

1.3.5 PCR试验 参照试剂盒说明书进行实时荧光定量，扩增条件：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，75 ℃延伸55 s，43个循环，75 ℃延伸5 min。目的基因和内参的引物设计：根据GeneBank提供VEGF-A、bFGF和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA序列，由上海华大分子生物技术研究所合成，见表1。反应结束分析荧光定量数据(扩增曲线、工作曲线、溶解曲线与相应Ct值等)，根据各组的平均△△Ct值用Light Cycler Software (Version 3.5)计算出每个目的基因相对于起始反应的拷贝数。

表1 目的基因的引物设计

2 结果

2.1 大鼠空腹血糖水平的变化 血糖监测结果显示，两组大鼠在治疗前和创面给药治疗后第3、7、14天血糖水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠空腹血糖比较(mmol/L)

2.2 大鼠创面愈合率观察 与对照组相比，观察组在第3、7、14天的创面愈合率显著提高(P<0.05)，创面愈合明显加快(P<0.05)。第14天，随着肉芽组织的大量形成和逐渐成熟，观察组创面基本完全愈合，创缘周边被毛覆盖，而对照组创面较红，尚有坏死组织和痂皮。见图1、表3。

图1 各组大鼠溃疡组织创面愈合情况

表3 各组大鼠创面愈合率比较(%)

注：分组因素主效应：F=8.428，P=0.016；时间因素主效应：F=535.463，P<0.001；分组*时间因素主效应：F=14.274，P<0.001

2.3 小鼠创面组织CD-34形成的影响 CD34为黏蛋白样血管递质素的一种，主要表达于血管内皮细胞、多能造血干细胞和骨髓基质细胞，可以根据检测创面CD34表达作为新生血管形成的标记。免疫荧光检测结果显示，观察组和对照组在第7天创面组织CD34阳性细胞数分别为34.39%±3.46%和12.42%±1.53%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 两组大鼠创面组织CD34阳性细胞比较(第7天，免疫荧光图，250×)

2.4 大鼠创面组织VEGF-A和bFGF基因表达情况 PCR检测结果显示，在第3、7、14天，观察组创面组织VEGF-A和bFGF mRNA表达均高于对照组(P<0.05)，见表4。

3 讨论

糖尿病性难愈创面由于反复发作、迁延不愈已成为临床工作中的一大难题，如何更有效地促进创面愈合对于减轻患者痛苦具有重要意义[4-5]。慢性难愈性创面属祖国医学“溃疡”的范畴，中医重视溃疡早期祛腐和后期煨脓长肉，对于糖尿病性难愈创面的“新肌”不生或难生等问题的解决具有一定优势[6-7]。近年研究发现，中医药对糖尿病性难愈创面具有显著疗效，徐杰男等[8]研究发现，补肾填精方能明显促进大鼠慢性难愈性创面修复愈合；张旭辉等[9]研究发现，回阳生肌膏及其不同拆方均能促进慢性皮肤溃疡大鼠创面愈合。补气生肌方是我院根据中医药“益气化瘀、去腐生肌、抗菌消炎”的原理自主研发的纯中药制剂，全方主要由黄芪、白术、川芎、当归、丹参、姜黄、白蔹、白芨组成，其中，黄芪、当归、白术增强免疫、益气托毒、补血活血、清热利湿，姜黄、丹参、川芎活血化瘀、凉血消痈、消炎抗菌，白蔹、白芨收敛止血、消肿生肌[10-12]。本研究发现，观察组采用补气生肌方治疗后创面愈合时间较对照组缩短，提示补气生肌方能促进糖尿病性难愈创面愈合。

糖尿病性难愈创面愈合过程涉及炎症反应、肉芽组织形成和重构等方面，其中肉芽组织形成是创面愈合的关键阶段，其通过修复创面组织的缺损，清除坏死组织，为上皮爬升创造条件[13-15]。肉芽组织形成过程需要新生血管的支持，丰富的新生毛细血管网能充实肉芽组织，从而改善创面的微循环，为其形成提供充分的氧气和营养物质，新生血管越多，肉芽组织生长越快，创面愈合时间缩短[16]。CD34是血管形成的重要标志，本研究免疫荧光检测结果显示，观察组在第7天创面组织CD34阳性细胞数高于对照组，提示补气生肌方较好的临床疗效可能与促进创面组织血管生成有关。

表4 大鼠创面组织VEGF-A和bFGF基因表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05

VEGF和bFGF是创面血管新生的主要调控因子。VEGF是唯一特异性作用于血管内皮细胞的促血管生成因子，其不仅能直接刺激血管内皮细胞有丝分裂，促进细胞增殖，还可增加血管的通透性，使血浆蛋白渗出，改变细胞外基质成分，以利于血管形成[17]。bFGF作为一组活性多肽，具有广泛的生物学作用，其能刺激血管内皮细胞分裂，诱发血管再生，是强烈的血管生长因子[18]。此外，近年研究发现，bFGF能趋化成纤维细胞和内皮细胞向创面迁移，增强肉芽组织细胞的有丝分裂、增殖及分化，并促进胞内蛋白质合成，从而有利于创面愈合[19-20]。本研究PCR结果显示，在第3、7、14天，观察组创面组织VEGF-A和bFGF mRNA表达均显著高于对照组，提示补气生肌方促进创面组织血管生成可能与上调VEGF-A和bFGF水平有关。

总之，补气生肌方在治疗糖尿病难愈性创面时，可增强VEGF-A和bFGF基因表达，促进创面组织血管生成，有利于难愈性创面的愈合和重建。

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MechanismofBuqiShengjiformulainimprovingtheangiogenesisandhealingofdiabeticrefractorywounds

CHEN Yu-jiaoa,BAI Xiao-sub,ZENG Li-hongc

(a.the Third Department of Internal Medicine,b.Department of Endocrinology,c.Department of Neurology,Longhua Area People′s Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 518000,China)

ObjectiveTo observe the influence of Buqi Shengji formula on angiogenesis of diabetic refractory wounds and vascular endothelial growth factor.MethodsSD male rats (n=48) were given intraperitoneal injection of 1% STZ 35 mg/kg after being fed with high-fat and high-sugar diet,and skin was scratched to establish the diabetic wound model after the diabetic model was established.The model rats were randomly divided into 2 groups.Observation group (n=24) was given Buqi Shengji formula,while control group (n=24) was given vaseline.The microvessel count in granulation tissue was determined by immunofluorescence,and the expression of VEGF and bFGF were determined by PCR.ResultsThe wound healing rate in observation group was higher than that of control group on the 3rd,7th and 14th day (P<0.05).The immunofluorescence results showed that the number of CD-34 positive cells was 34.39%±3.46% in observation group and 12.42%±1.53% in control group respectively,and there was significant difference between the two groups (P<0.05).The expression of VEGF-A and bFGF mRNA in the wound tissue of observation group was higher than that of control group on the 3rd,7th and 14th day (P<0.05).ConclusionBuqi Shengji formula can up-regulate the expression of VEGF-A and bFGF gene in the treatment of diabetic refractory wounds,and promote the angiogenesis of wound tissue which is beneficial to the healing and reconstruction of refractory wounds.

Buqi Shengji formula;Diabetes;Wound;Blood vessels

2016-12-22

深圳市龙华区人民医院a.内三科，b.内分泌科，c.神经内科，深圳 518000

10.14053/j.cnki.ppcr.201710006