miR-106a在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞系A498增殖的影响

马亚东,白世安,宋红雄,强亚勇,胡海峰

(延安大学附属医院泌尿外科,延安 716000;*通讯作者,E-mail:wangziming201415@126.com)

miR-106a在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞系A498增殖的影响

马亚东*,白世安,宋红雄,强亚勇,胡海峰

(延安大学附属医院泌尿外科,延安 716000;*通讯作者,E-mail:wangziming201415@126.com)

目的 研究miR-106a在肾癌、癌旁正常组织表达情况及其在肾癌细胞系A498中的作用。 方法 运用real-time PCR检测33例肾癌及相应的癌旁正常组织中miR-106a的表达，分析其与临床病理特征的相关性;在肾癌A498细胞中转染miR-106a过表达载体及其抑制剂,实验分为4组:空载体对照组、miR-106a过表达载体组、阴性对照组、miR-106a抑制剂组;MTT实验检测miR-106a对肾癌A498细胞增殖的影响;应用流式细胞仪分析miR-106a对细胞周期的影响。 结果 miR-106a在肾癌组织中的表达显著上调(P<0.01),并与肾癌的T分期有相关性(P<0.05)。miR-106a过表达载体与空载体对照组相比,促进了细胞增殖,G0/G1期细胞数量显著减少(P<0.01),S和G2/M期细胞数量显著增加(P<0.01);而miR-106a抑制剂组与阴性对照组相比,细胞增殖抑制,G0/G1期细胞数量显著增加(P<0.01),S和G2/M期细胞数量显著减少(P<0.01)。 结论 miR-106a在肾癌组织中上调,通过促使细胞进入S和G2/M期而促进肾癌细胞分裂、增殖。

miR-106a; 细胞增殖; 细胞周期; 肾癌

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,在泌尿系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌位居第二位,占肾脏恶性肿瘤的85%[1]。肾癌的发病率逐年升高,早期没有特异性症状,许多患者发现时已进入晚期[2]。目前,手术仍然是肾癌的主要治疗方法,而放疗、化疗和生物靶向治疗效果差强人意。因此,加强对肾癌发生发展机制和早期诊断相关的分子标志物的研究尤为重要。

微小RNAs(microRNAs,miRNAs,miR)是一类高度保守的非编码单链RNA分子,约由21-25个核苷酸组成[3]。miRNAs与靶mRNA特异性地碱基互补配对结合,促进靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,从而在转录后水平调控基因表达,参与细胞存活、增殖、分化、凋亡,机体的发育、代谢,及肿瘤的发生发展等多种生物学过程[4]。在肿瘤的发生发展过程中,miRNAs会通过调控与肿瘤相关的癌基因或抑癌基因的表达来发挥其作用[5]。因此,本研究采用real-time PCR方法检测miR-106a在肾癌组织与癌旁正常对照组织中的表达情况,在肾癌细胞中转染miR-106a过表达载体及miR-106a抑制剂,分析miR-106a对肾癌细胞增殖的影响,为探索肾癌发病机制及诊断治疗的研究提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2015-03～2016-05延安大学附属医院泌尿外科手术切除的肾癌组织及其相对应的癌旁正常组织33对,手术后均经病理检查确认。收集的样本在液氮中长期保存。采集样本前经过医院伦理委员会批准以及获得患者知情同意。人肾癌细胞系A498购于西安交通大学第一附属医院转化医学中心。

1.2 主要试剂与仪器

1.3 实时荧光定量PCR(real-time PCR)

将临床肾癌样本组织、癌旁正常组织、A498细胞(分别转染空载体、miR-106a过表达载体、阴性对照、miR-106a抑制剂)利用RNA提取试剂盒,提取细胞RNA。分别加入特异性茎环引物(内参U6-RT:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-106a-RT:5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTACCTG-3′),依照试剂盒说明书操作逆转录cDNA,反应温度:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。real-time PCR反应,按照序列设计引物。内参U6引物Forward:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6引物Reverse:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-106a引物Forward:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,Reverse:5′-TGCTAAAAGTGCTTACAGTG-3′。扩增条件:95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环,72 ℃延伸5 min终止反应。所有样品均设立4个复孔,通过2-ΔΔCt法分析real-time PCR数据。肾癌组织中miR-106a相对值>1认定为高表达,≤1认定为低表达。分析miR-106a表达与临床病理特征的关系。

1.4 构建miR-106a过表达载体及合成其抑制剂

从miRbase数据库获得hsa-miR-106a的前体序列(5′-CCTTGGCCATGTAAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGCTTTTTGAGATCTACTGCAATGTAAGCAC-TTCTTACATTACCATGG-3′),在两端分别构建EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将该序列插入到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒中,再由上海生工生物工程有限公司进行筛选、测序鉴定。miR-106a抑制剂的阴性对照(5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)和miR-106a抑制剂(5′-CUACCUGCACUGUAAGCACUUUU-3′)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 细胞培养与转染

人肾癌细胞系A498细胞采用10%胎牛血清的DMEM培养基,在5%CO2,37 ℃培养箱中培养,取对数生长期的A498细胞进行后续实验。实验分组为:空载体对照组、miR-106a过表达载体组、阴性对照组、miR-106a抑制剂组(仅转染miR-106a抑制剂)。细胞在培养24 h时,各组依照TurboFect转染说明书瞬时转染。

1.6 MTT实验检测miR-106a对A498细胞增殖的影响

转染前24 h以5 000个/孔将A498细胞种植于96孔板。分别转染空载体、miR-106a过表达载体、阴性对照、miR-106a抑制剂,每组设5个复孔。转染后24，48，72 h分别加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,继续培养4 h后吸弃上清液,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒,而死细胞无有活性的琥珀酸脱氢酶,然后加入150 μl DMSO溶解甲瓒,用微板测试仪在490 nm波长处检测OD值,以此来分析细胞生长活力。OD值越高表示细胞的生长活力增加,反之则表示细胞的生长活力降低。

1.7 流式细胞仪检测miR-106a对A498细胞周期的影响

上述各组细胞转染48 h时收集单细胞悬液,每组均3个复孔,预冷的PBS洗涤,用75%乙醇固定12 h;再加入浓度为100 μg/ml碘化丙啶染液0.5 ml染色,室温下静置10 min;采用流式细胞仪检测,利用随机软件Modfit LT分析A498细胞的DNA含量变化,进而分析细胞周期变化。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 肾癌中miR-106a的表达及其与临床病理特征的关系

应用real-time PCR检测33对肾癌组织及癌旁正常组织miR-106a的表达变化。结果表明,miR-106a在肾癌组织中有24例高表达,9例低表达;统计分析显示,与癌旁正常组织相比,miR-106a在肾癌组织中表达显著上调(P<0.01,见图1)。miR-106a的表达与肾癌的T分期有关(P<0.05),而在不同年龄、性别、组织类型、M分期和N分期等患者中miR-106a表达差异均无统计学意义(见表1)。

图1 miR-106a在肾癌组织中表达上调Figure 1 The miR-106a expression increases in renal carcinoma tissues

表1miR-106a的表达与临床病理特征的关系

Table1CorrelationofmiR-106aexpressionwithclinicopathologicalcharacteristics

临床病理特征nmiR⁃106a表达水平高表达(n=24)低表达(n=9)χ2P 年龄03860653 ≥60岁21165 <60岁1284 性别04050518 男23176 女1073 组织类型02160137 透明细胞癌19145 乳头状细胞癌642 其他类型癌862 T分期53820016 T118117 T2981 T3、T4651 M分期02160252 M020146 M113103 N分期01280376 N024186 N1、N2963

2.2 miR-106a对肾癌A498细胞增殖的影响

结果表明,与空载体对照组相比,miR-106a过表达载体组miR-106a表达显著上调(P<0.01),上调至73.62倍;转染抑制剂后miR-106a表达显著下调(P<0.05),下调至0.71倍(见图2)。应用MTT比色法实验分析miR-106a对肾癌A498细胞增殖活力的影响，结果显示，与空载体对照组相比,miR-106a过表达载体在转染48,72 h时A498细胞的增殖活力显著增强,促进了细胞增殖(P<0.01);与阴性对照组相比,转染miR-106a抑制剂48,72 h时A498细胞的增殖活力显著降低,抑制了细胞增殖(P<0.01,见图3),这证明miR-106a可促进肾癌A498细胞的增殖。

与空载体对照比较，*P<0.01A.转染miR-106a表达载体后miR-106a表达 与阴性对照比较，#P<0.05B.转染miR-106a抑制剂后miR-106a表达图2 在肾癌A498细胞中转染miR-106a过表达载体和抑制剂后miR-106a表达Figure 2 The miR-106a expression after transcription miR-106a overexpression vector and inhibitor in renal carcinomaA498 cells

同时点与空载体对照组相比,*P<0.01;同时点与阴性对照组相比,#P<0.01图3 MTT比色法分析miR-106a对A498细胞增殖的影响Figure 3 Effect of miR-106a on the A498 cell proliferation by MTT assay

2.3 miR-106a对肾癌A498细胞周期的影响

在分别转染miR-106a过表达载体和抑制剂48 h时,采用流式细胞仪检测细胞周期。miR-106a过表达载体组与空载体对照组相比,G0/G1期细胞数量显著减少(P<0.01),S期细胞数量显著增加(P<0.01),G2/M期细胞数量也显著增加(P<0.01);miR-106a抑制剂组与阴性对照组相比,G0/G1期细胞数量显著增加(P<0.01),S期细胞数量显著减少(P<0.01),G2/M期细胞数量也显著减少(见图4)。结果表明,miR-106a可促进肾癌A498细胞跨过在G0/G1-S期节点,使肾癌A498细胞进入S和G2/M期进行分裂和增殖。

与空载体对照组相比,*P<0.01;与阴性对照组相比,#P<0.01图4 miR-106a对A498细胞周期的影响Figure 4 Effect of miR-106a on the cell cycle of A498 cells

3 讨论

MiRNAs是一类小片段非编码的单链RNA分子。MiRNAs可通过与靶基因的非翻译区(untranslated region,UTR)结合,在转录后水平调控其靶基因的表达。近年来研究表明,哺乳动物内大多数基因表达受miRNAs的调节,miRNAs广泛参与细胞存活、生长、发育、分化、代谢、凋亡等多种生理活动[6]。MiRNAs的表达异常与胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展关系密切[7-9]。例如,miR-19b-1、miR-193b-3p、miR-21、miR-27a、miR-99b-5p等在肾癌中表达异常,并与肾癌的进展相关[10,11]。近期的研究发现,miR-106a在肺癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌等多种类型的肿瘤组织中表达上调,并通过调控不同的信号通路来调节细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。然而,miR-106a在肾癌中的表达水平及其作用仍不清楚,对miR-106a的研究将加深对肾癌发病机制的理解,为肾癌的早期诊断和治疗提供新的思路。

本研究发现,与癌旁正常组织相比,miR-106a在肾癌组织中高表达,并与肾癌的T分期相关。在肾癌细胞系A498细胞的体外实验中,通过转染miR-106a过表达载体和抑制剂,进一步观察其对A498细胞增殖能力及细胞周期的影响。结果发现,与空载体组相比(排除空质粒载体对细胞的影响),转染miR-106a过表达载体可促使A498细胞进入S和G2/M期进行分裂和增殖;而与阴性对照组相比(由于采用无效的RNA序列,则可排除RNA本身对细胞的影响),转染miR-106a抑制剂可使A498细胞阻滞在G0/G1期,抑制了细胞增殖。从而证明了miR-106a可影响肾癌A498细胞的生物学功能,可能与肾癌的发病机制及进展密切相关。

肾癌大约占成年人恶性肿瘤3%,并且其发病率呈现逐年上升趋势[12]。肾癌的早期无特异性症状,仅有少部分患者会出现肾癌三联征(疼痛、血尿、肿块)。大多数患者发现时已经为晚期,且预后极差。目前影响肾癌发生发展的分子机制尚未阐明。miRNAs主要是通过作用于下游的靶基因发挥作用。在非小细胞肺癌中,miR-106a通过靶向调控PTEN表达促进肿瘤生长和转移[10]。在结直肠癌中,miR-106a通过靶向调控ATG7表达抑制肿瘤细胞凋亡[11]。在胃癌中,miR-106a通过靶向调控FAS表达抑制胃癌细胞凋亡[13]。下一步将通过生物信息学工具(miRbase Target,PicTar和TargetScan)预测miR-106a可能的靶基因,进一步研究miR-106a影响肾癌细胞增殖的分子机制,揭示肾癌进展的作用靶点。如能通过miR-106a寻找到肾癌发生发展的分子机制,将可能为肾癌的早期诊断提供分子标志物以及治疗提供分子靶点,从而提高肾癌的早期诊断率及提供更加有效的新治疗方案。

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ExpressionofmiR-106ainrenalcancertissuesanditseffectontheproliferationofrenalcancercelllineA498

MA Yadong*,BAI Shian,SONG Hongxiong,QIANG Yayong,HU Haifeng

(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;*Correspondingauthor,E-mail:wangziming201415@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-106a in human renal cancer tissues and its role in renal cancer cell line A498.MethodsThe miR-106a expression was detected in 33 cases of renal cancer by real-time PCR. The correlation of miR-106a expression with clinicopathological characteristics was analyzed. MiR-106a overexpression vector and miR-106a inhibitor were transfected into A498 cells. A498 cells were divided into four groups: empty vector control group, miR-106a overexpression vector group, negative control group and miR-106a inhibitor group. The proliferation of A498 cells was examined by MTT assay.The effect of miR-106a on the cell cycle of A498 cells was observed by flow cytometer.ResultsThe expression of miR-106a was significantly up-regulated in renal cancer tissues(P<0.01). High miR-106a expression was associated with T stage(P<0.05). Compared with empty vector control group, A498 cell proliferation was promoted in miR-106a overexpression vector group, the proportion of G1/G0phase cells was decreased(P<0.01), and the proportion of S and G2/M phase cells was increased(P<0.01). Compared with negative control, miR-106a inhibitor suppressed A498 cell proliferation, increased the proportion of G1/G0phase cells(P<0.01), and decreased the propor-tion of S and G2/M phase cells(P<0.01).ConclusionThe expression of miR-106a may increase in renal cancer tissues, and promote the division and proliferation of renal cancer A498 cells through driving cells into S and G2/M phases.

miR-106a; cell proliferation; cell cycle; renal cancer

R737.11

A

1007-6611(2017)09-0935-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.015

国家自然科学基金资助项目(81660492);陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4122)

马亚东,男,1975-04生,博士,副主任医师,讲师,E-mail:wangziming201415@126.com.

2017-06-14