γ-分泌酶抑制剂在哮喘小鼠模型Th17/Treg平衡失调中的作用

辛 娜,李敬梅,王永锋,王 瑶,陈 婕,杨 超,吴跃刚

(1西安医学院第一附属医院检验科,西安 710077;2西安市华山中心医院呼吸内科;*通讯作者,E-mail:3150167845@qq.com)

γ-分泌酶抑制剂在哮喘小鼠模型Th17/Treg平衡失调中的作用

辛 娜1,李敬梅1,王永锋1,王 瑶1,陈 婕1,杨 超1,吴跃刚2*

(1西安医学院第一附属医院检验科,西安 710077;2西安市华山中心医院呼吸内科;*通讯作者,E-mail:3150167845@qq.com)

目的 研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对哮喘气道炎症、气道高反应和Th17/Treg失衡的干预作用,为其抗哮喘活性制剂的研究与开发提供理论依据。 方法 6-8周雌性C57BL/6小鼠45只被随机分为对照组,哮喘组和DAPT组,每组15只苏木精-伊红(HE)染色法观察气道病理改变,酶联免疫吸附法检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子和炎性介质的水平,逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)分析脾脏Foxp3 mRNA的表达。 结果 DAPT组较哮喘组气道炎症明显减轻,气道内黏液分泌显著减少。哮喘组IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分别为(695±148)ng/ml,(58±6)pg/ml, (148±12)pg/ml,(18±3)pg/ml; DAPT组IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分别为(486±152)ng/ml,(27±6)pg/ml,(193±17)pg/ml,(33±5)pg/ml。与哮喘组比较,DAPT组气道灌洗液中IL-17、IgE水平显著降低(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平显著增加(P<0.01),Foxp3 mRNA的表达也显著增加(P<0.01)。 结论 γ-分泌酶抑制剂DAPT具有抗哮喘小鼠Th17/Treg失衡的作用。

支气管哮喘; Notch信号; γ-分泌酶抑制剂; Th17/Treg失衡; 小鼠

过去几年,对哮喘患者体内Th亚群的研究主要集中在Th1和Th2细胞,普遍认为在哮喘患者中存在Th1/Th2平衡失调。Th17/Treg细胞平衡是新近发现的一个重要免疫平衡,该比例失衡在哮喘的发病机制中起到关键作用。近几年的研究表明,哮喘患者体内存在Th17/Treg功能的失衡,Th17细胞免疫优势反应在哮喘的发病机制中起到关键作用[1]。对于Th17/Treg免疫失衡的调节成为当前治疗支气管哮喘的新策略。Notch信号通路在中枢和外周免疫系统中各种细胞发展成熟的不同阶段,尤其是外周T细胞的分化过程中均发挥了重要作用[2]。然而,Notch信号通路在哮喘患者Th17/Treg失衡中的确切机制还有待进一步研究。γ-分泌酶是Notch信号通路激活过程中的一个关键因素,γ-分泌酶抑制剂DAPT是Notch信号通路有效的阻断剂。本研究以BALB/c小鼠哮喘模型,研究DAPT对哮喘气道炎症、气道高反应和Th17/Treg失衡的干预作用。

1 材料和方法

1.1 实验小鼠

6-8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠,体质量为22-25 g,购自第四军医大学实验动物中心[动物合格证号:SCXK(京)20100008]。

1.2 主要试剂

卵清蛋白OVA(批号:1000739125),氢氧化铝佐剂(批号:MKBC0615)购自美国Sigma公司。小鼠IL-17、IL-10、TGF-β1、IgE ELISA检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。γ-分泌酶抑制剂DAPT购自上海高创化学科技有限公司。RT-PCR反应引物由广州行知生物科技有限公司合成。

1.3 哮喘模型建立

雌性C57BL/6小鼠45只被随机分为正常对照组、哮喘模型组和DAPT组,每组15只。哮喘组、DAPT组小鼠经腹腔注射OVA+Al(OH)3混悬液致敏(致敏液为每0.2 ml内含100 μg OVA的Al(OH)3PBS溶液)建立哮喘小鼠模型,DAPT组于激发前30 min经气道给予DAPT(0.3 mg/kg)。正常对照组以生理盐水代替OVA进行腹腔注射及雾化吸入。

1.4 小鼠肺泡灌洗液采集

各组小鼠末次激发后24 h脱颈处死小鼠,固定后打开胸腔,分离肺组织,经气管缓慢注射PBS 0.3 ml,回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalverolar lavage fluid,BALF),共3次,回收率超过80%。

1.5 BALF中细胞计数

将收集到的小鼠BALF 1 200 r/min离心5 min,收集底部细胞沉淀,用0.8 ml D-Hanks液重悬,取0.1 ml采用血细胞计数仪测定细胞总数,取0.2 ml涂片,瑞氏染色,至少计数200个细胞作细胞分类计数。

1.6 ELISA检测BALF中IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1表达水平

实验参照试剂盒内说明书进行,经酶标仪检测OD450值,带入标准曲线计算实际浓度。

1.7 肺组织病理分析

取小鼠左下叶肺组织制病理切片,HE染色,光学显微镜下观察炎症及嗜酸性粒细胞浸润情况。

1.8 Foxp3 mRNA的RT-PCR反应

取小鼠脾脏组织,利用Trizol法提取细胞内总RNA,建立RT-PCR反应体系。Foxp3引物序列上游5′-GTG GCC CGG ATG TGT GAA G-3′,下游5′-GGA GCC CTT GTC GGATGA TG-3′;β-actin 上游5′-CCT TCC TGG GCATGG AGT CCT G-3′,下游5′-GGA GCAATG ATC TTG ATC TTC-3′。循环条件:预变性,95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,65 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40次循环。将PCR扩增产物10 μl与2 μl上样缓冲液混合后点样于2%琼脂糖凝胶上,在100 V/cm电压下电泳30 min,立即置于紫外线透射检测仪下观察,扫描输入计算机,然后使用Gel-pro analyzer 软件进行光密度测量,Foxp3 mRNA条带的光密度值分别与β-actin条带的光密度值进行比较,以其比值表示Foxp3 mRNA表达的相对强度。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 DAPT对BALF中白细胞计数的影响

哮喘模型组小鼠BALF中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量较正常对照组增加(P<0.01),DAPT组比哮喘模型组明显减少(P<0.01,见表1),结果表明DAPT可以明显减少哮喘小鼠BALF中各类细胞数。

表1DAPT对哮喘小鼠BALF白细胞的抑制作用

Table1InhibitionofDAPTonnumbersoftotalWBCandleukocytesinBALFinamousemodelofallergicasthma

组别白细胞总数(×104/ml)嗜酸性粒细胞(×104/ml)淋巴细胞(×104/ml)中性粒细胞(×104/ml)正常对照组 78±15 01±00 28±15 00±00哮喘模型组721±138∗428±72∗105±27∗101±16∗DAPT组470±89#291±83# 52±23# 43±18#

与正常对照组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.01

2.2 DAPT对肺组织病理变化的影响

正常对照组气道周围组织未见炎细胞浸润,小鼠气道上皮光滑平整。哮喘模型组小鼠气道组织可见大量的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润,DAPT组小鼠肺组织较哮喘组气道炎症明显减弱(见图1)。结果表明,DAPT具有抑制过敏原引发的气道炎症和黏液分泌的作用。

A.正常对照组(×400) B.哮喘模型组(×200) C.DAPT组(×400)图1 HE染色观察DAPT对小鼠气道炎症的抑制作用Figure 1 Inhibition of DAPT on allergic airway inflammation of model mouse by HE

2.3 DAPT对BALF中细胞因子及炎性介质的影响

与正常对照组比较,哮喘模型组IL-17、IgE显著增加(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平显著降低(P<0.01);与哮喘模型组比较,DAPT组IgE水平、IL-17显著降低(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平显著增加(P<0.01,见表2),结果表明DAPT可以显著下调Th17型细胞因子IL-17及上调Treg型细胞因子IL-10和TGF-β1。

表2DAPT对哮喘小鼠BALF中细胞因子及炎性介质的作用

Table2EffectsofDAPToncytokineandinflammatorymediatorlevelsinBALFinamousemodelofallergicasthma

组别IgE(ng/ml)IL⁃10(pg/ml)IL⁃17(pg/ml)TGF⁃β1(pg/ml)正常对照组135±21198±521±248±5哮喘模型组695±148∗148±12∗58±6∗18±3∗DAPT组486±152#193±17#27±6#33±5#

与正常对照组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.01

2.4 DAPT对脾脏Foxp3 mRNA表达的影响

与正常对照组相比,哮喘模型组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达显著下降(P<0.01)。与模型组比较,DAPT组Foxp3 mRNA表达显著增加(P<0.01,见表3,图2)。

表3不同组别小鼠脾脏Foxp3mRNA的相对表达量

Table3TherelativeexpressionofspleenFoxp3mRNAinamousemodelindifferentgroups

组别Foxp3mRNA相对表达量(光密度比) 正常对照组235±043 哮喘模型组038±016∗ DAPT组183±032#

与正常对照组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.01

图2 DAPT对哮喘小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达的作用Figure 2 Effects of DAPT on the spleen Foxp3 mRNA expression in a mouse model of asthma

3 讨论

Th17/Treg细胞平衡是新近发现的一个重要免疫平衡,Th17细胞是一种辅助性T细胞,其通过产生一种前炎性细胞因子IL-17参与调控哮喘炎性细胞的浸润和气道重塑过程。Treg细胞是一群具有调节功能的T细胞,与Th17细胞在功能上存在平衡关系,该细胞以分泌IL-10及TGF-β1为主要特征,Foxp3蛋白是其主要的转录因子,功能以调节尤其是抑制免疫反应为主。近年来,Th17/Treg比例失衡在哮喘的发病机制中作用的研究越来越多[3,4]。研究表明哮喘患者体内存在Th17/Treg功能的失衡,Th17细胞免疫优势反应在哮喘的发病机制中起到关键作用,而增强Treg细胞功能则能够有效抑制Th17细胞的优势反应[5]。

Notch信号通路是目前公认的调控细胞分化极为重要的信号转导系统,是包括细胞增殖、分化和凋亡在内的各种细胞功能的关键调节者[6]。γ-分泌酶是Notch信号途径调节的核心环节,γ-分泌酶复合物主要由早老蛋白、Nicastrin蛋白、Pen-2和Aph-1等4种蛋白组成。γ-分泌酶参与了Notch信号途径的酶解过程,阻断γ-分泌酶的作用会减少具有活性的Notch胞内区(Notch intracellular domain,NICD)的产生;由于缺乏NICD,下游信号分子处于静止状态,从而使干细胞进入分化程序。DAPT是Notch信号有效的阻断剂,DAPT通过作用于早老素而抑制γ-分泌酶的作用,从而减少产生NICD。许多研究表明,Notch信号通过调节Th1/Th2参与哮喘的发生、发展[7,8]。贾建厚等[9]的研究发现γ-分泌酶抑制剂DAPT可有效降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平,提升IFN-γ水平,纠正Th1/Th2失衡。然而,Notch信号在哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用及机制研究较少。

为了研究Notch信号在哮喘患者Th17/Treg失衡中的作用及机制,笔者以BALB/c小鼠哮喘模型,通过气道内给予Notch信号阻断剂DAPT阻断Notch信号通路,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,计数支气管肺泡灌洗液中白细胞总数及分类;酶联免疫吸附法检测BALF中细胞因子和炎性介质的水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察气道病理改变,RT-PCR方法检测Treg细胞相关转录因子Foxp3的mRNA表达情况,研究γ-分泌酶抑制剂对哮喘气道炎症、气道高反应和Th17/Treg失衡的干预作用。研究结果显示,哮喘模型组IL-17较正常对照组显著升高,IL-10和TGF-β1较正常对照组显著减少,提示IL-17促进了中性粒细胞及嗜酸性粒细胞在气道聚集,从而参与哮喘气道炎症的发生。IL-10和TGF-β1作为Treg型细胞因子,具有抗炎、免疫抑制等作用,其减少表明在哮喘的发生过程中Treg细胞的免疫抑制作用减弱,Treg不能有效抑制Th17过亢引起的气道反应性增加,最终加重哮喘,这与目前的研究结果一致[10]。采用DAPT阻断Notch信号能明显抑制IL-17,故推断DAPT抑制Notch信号能够干扰IL-17的分泌,IL-17的分泌可能依赖于Notch信号。另外,其他研究通过采用siRNA干扰Notchl基因,发现特异性抑制Notchl的表达能够降低极化的人类Thl7细胞中IL-17A和IL-17F的产生[11],这与本研究结果一致。采用DAPT阻断Notch信号后,IL-10和TGF-β1水平显著增加,Foxp3 mRNA的表达也显著增加。Foxp3是调节Treg细胞分泌相关细胞因子如IL-10和TGF-β1的重要转录因子,因此DAPT抑制Notch信号可能通过上调Foxp3的表达逆转Thl7/Treg失衡,由于Treg细胞的调节是一个复杂的问题,是通过Notch和TGF-β等多种信号转导通路彼此相互作用完成的[12],具体的分子机制还需要进一步研究。

本研究表明,DAPT能够显著地抑制小鼠过敏性气道炎症及气道高反应,说明其具有一定的抗哮喘作用。另外,DAPT显著地下调Th17型细胞因子IL-17及上调Treg型细胞因子IL-10和TGF-β1,同时增加Foxp3 mRNA表达的作用,提示纠正Th17/Treg功能的失衡可能为其抗哮喘的主要机制。但γ-促分泌酶抑制剂还多用于体外试验及动物实验阶段,筛选出有作用选择性地能适用于临床的γ-促分泌酶抑制剂将对哮喘有潜在的治疗价值。

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Roleofγ-secretaseinhibitorintheimbalanceofTh17/Treginamouseasthmaticmodel

XIN Na1,LI Jingmei1,WANG Yongfeng1,WANG Yao1,CHEN Jie1,YANG Chao1,WU Yuegang2*

(1DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,HuashanCenterHospitalofXi’an;*Correspondingauthor,E-mail:3150167845@qq.com)

ObjectiveTo explore the effects of γ-secretase inhibitor(DAPT) on the airway inflammation, the airway hyperactivity and the imbalance of Th17/Treg in a mouse model of allergic asthma for providing a theoretical basis for the research and development of anti-asthma activity preparations.MethodsForty-five female C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: control group, asthma group and DAPT group. The pathological changes of lung tissue were analyzed by hematoxylin-eosin staining. Levels of cytokine and inflammatory mediators in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression of Foxp3 mRNA in spleen was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsThe airway inflammation and mucus secretion were alleviated in DAPT group compared with asthma group. The contents of IgE, IL-17, IL-10 and TGF-β1in asthma group were (695±148)ng/ml,(58±6)pg/ml,(148±12)pg/ml,(18±3)pg/ml, respectively. The contents of IgE,IL-17,IL-10 and TGF-β1in DAPT group were (486±152)ng/ml,(27±6)pg/ml,(193±17)pg/ml,(33±5)pg/ml, respectively. Compared with asthma group, the levels of IgE and IL-17 were significantly decreased in DAPT group(P<0.01), the levels of IL-10, TGF-β1and the expression of Foxp3 mRNA were significantly increased in DAPT group(P<0.01).ConclusionThe γ-secretase inhibitor DAPT may efficiently regulate the imbalance of Th17/Treg to balance a mouse asthmatic model.

asthma; Notch signal; γ-secretase inhibitor; imbalance of Th17/Treg; mice

R

A

1007-6611(2017)09-0918-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.011

陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK1647)

辛娜,女,1981-09生,硕士,主治医师,讲师,E-mail:xnr0919@163.com

2017-05-13