干细胞诱导分化为肝细胞调控机制研究进展

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同济大学附属同济医院普外科,上海 200065

·综述·

干细胞诱导分化为肝细胞调控机制研究进展

肖帅(综述),施宝民(审校)

同济大学附属同济医院普外科,上海200065

干细胞(stem cell)是一类可自我复制的多潜能细胞。目前发现,通过体外诱导多种干细胞可分化为肝样细胞,并有肝细胞的表面标记及功能。肝移植为终末期肝病的最有效治疗方式,但面临供肝不足、费用大、长期免疫治疗等诸多限制。因此,干细胞在治疗终末期肝病方面显现出潜在的应用价值。文章重点综述干细胞分化为类肝细胞的调控机制进展。

干细胞; 分化; 调节机制; 肝细胞

全世界每年有超过100万患者死于肝衰竭。肝移植一直被视为终末期肝病的有效治疗方法,但由于供肝不足、费用较高、长期服用免疫抑制剂等原因限制了其临床推广[1]。干细胞有着自我复制和分化为其他类型细胞的潜能。20多年的研究证实,多种类型的干细胞可通过分离纯化、定向培养成有功能的肝样细胞,在一定程度上改善或者逆转肝功能,但结果并不理想。如何提高移植效率从而更好地改善肝功能是目前在这一领域的研究重点和难点。

1 干细胞来源和分类

1.1 胚胎来源干细胞

胎肝细胞是胚胎时期分裂形成肝脏的前体细胞,可以分化为肝细胞和胆管细胞,有着巨大的分化潜能。其分化过程中不存在分化方向选择的问题,而且相对于其他组织来源的干细胞有着更加持久的分化能力,在适当条件下可分化为肝细胞和胆管细胞,进而形成肝小叶重建。胚胎干细胞(ES cell)在20世纪80年代首次被认识,当时从小鼠囊胚细胞中分离而来[2],有很高的分化潜能,是一种高度未分化细胞,可以分化为任一胚层细胞,甚至包括认为是不能再生的神经组织[3],也是肝细胞分化来源之一。但这种干细胞来自胚胎,由于受伦理道德争议目前主要用于动物实验而临床研究与应用受限[4]。

1.2 卵圆细胞

卵圆细胞是1944年首次在诱发肝癌中被发现,后于1956年研究肝癌时观察到的肝门管区一类细胞,命名为卵圆细胞[5]。该细胞是一种干细胞,具有多向分化潜能[6]。按其来源可分为肝源性和非肝源性,肝源性卵圆细胞由肝内终末胆管干细胞发育而来,部分卵圆细胞因与骨髓造血干细胞有相同细胞表面标志故认为可能由骨髓造血干细胞横向分化并迁入肝内发育而来[7]。在肝受损时,刺激炎症细胞分泌炎性递质(TNF-α和IFN-γ),激活卵圆细胞增殖及分化为肝细胞或胆管细胞,最终组建新的肝小叶从而改善肝功能。

1.3 间充质干细胞

骨髓中有骨髓间充质干细胞和造血干细胞。骨髓间充质干细胞为中胚层发育的早期细胞,在一定条件下可分化为肝细胞、骨骼组织及软骨组织等,表面可有多种标志物如IL-1R、IL2-R等干扰素表面受体,CD166、CD54等黏附分子,具有体外易得、自体来源、免疫原性较弱且可多次移植等优点,在干细胞移植方面有着独特的优势[8]。其他还有脐带血干细胞、脂肪组织干细胞和胰腺导管上皮细胞等,在一定诱导条件下也可分化为有功能的肝细胞。

2 分化调控

干细胞分化调控机制复杂,针对不同干细胞涉及核酸、细胞因子、外源诱导分化剂及细胞形态和极性形成等多个环节。

2.1 核酸

miRNA是一类短链非编码核苷酸,研究发现miRNA对细胞的新陈代谢及生命活动调节起重要作用。2008年Ivey等[9]发现miRNA对于胚胎干细胞分化起调控作用。2013年Cui等[10]通过分析人脐带血间充质干细胞向肝样细胞分化中所涉及到的miRNA并对比干细胞分化前后miRNA发现,miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424 和 miR-542-5p等在分化过程中呈高表达;通过慢病毒介导的miRNA抑制剂体外抑制miR-1246、miR-1290、miR-148a,miR-30a、miR-424和miR-542-5p表达,细胞摄取低密度脂蛋白效率降低,细胞功能受到抑制;将分化的肝细胞导入肝损伤动物模型可改善肝细胞功能。故表明上述miRNA可促进干细胞向有功能肝细胞分化。Cui等[11]在2012年在实验中也发现,miR-1246有人脐带血间充质干细胞向肝样细胞分化的类似作用。

miR-122是肝细胞特有miRNA[12],最早由Moroy于1989年研究肝癌时发现,后来发现her基因即为miR-122前体。Lagos-Quintana等[13]在2002年报道,小鼠肝组织miR-122特异高表达。2013年Doddapaneni等[14]体外培养CD34、CD117双阳性胎肝细胞时观察到,miR-122和肝细胞特有基因表达水平呈正相关。研究表明,高表达miR-122能促进胎肝细胞分化及AFP、ALB表达,且AFP含量逐渐降低,这从侧面说明干细胞越来越成熟。2015年,Chien等[15]报道,在体外诱导鼠胎肝细胞分化中,高表达miR-122的细胞含有更高水平的HNF-3β、HNF-4α,说明miR-122在细胞分化中启动了肝细胞自有的分化调控体系。2014年伊朗学者Davoodian等[16]在探究miR-122在脂肪组织间充质干细胞分化的作用时观察到,miR-122高表达与ALB、AFP、CK18及CK19等多种蛋白正相关性。

这些实验说明,miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424、miR-542-5p和miR-122可以促进干细胞向有功能肝样细胞的分化及成熟。

2.2 细胞因子

2.2.1 肝细胞核因子4α

肝细胞核因子4α(HNF-4α)是通过调节肝内基因特异性表达而控制肝细胞功能和肝脏发育的一类转录因子[17]。2014年Laudes等[18]报道,人脐带血间充质干细胞HNF-4α高表达,且转染HNF-4α的干细胞与对照组相比有更高的ALB、G-6-P及CYP3A4表达水平。另有报道,干细胞分化有关细胞因子(HNF6及CEBP/α)高表达,Wnt-β-catenin通路则受抑制;而当细胞被HNF-4α转染则这种抑制作用增强。说明HNF-4α可促进干细胞分化及成熟。

2.2.2 调节转录因子Foxa2

FOXA(forkhead box A)是一组调节哺乳动物胚胎期器官形成及新陈代谢的重要基因,也称肝核转录因子3(HNF3)。哺乳动物的FOXA家族包括FOXA1、FOXA2和FOXA3[19]。Liu 等[20]在2013年报道,胚胎干细胞分化过程中将细胞分为Foxa2、HNF-4α及Foxa2/HNF-4α共3组,免疫荧光检测Foxa2组细胞表达ALB、AFP、CK-18、AAT最多,HNF-4α组肝细胞蛋白量最低,说明人工导入Foxa2可促进干细胞分化及成熟,且HNF-4α可能有促进Foxa2作用,而Foxa2、HNF-4α表达同时增强并无明显促分化作用,其蛋白含量甚至还低于单纯Foxa2组。Hang的实验也证实,HNF-4α有促进干细胞分化及成熟作用。区别在于两者在干细胞分化过程中的各自时间特异性,HNF-4α主要作用于分化中晚期。亦可能是实验条件不一致导致结果各异。

2.2.3 肝X受体α

肝X受体α(NR1H3)属于配体活化的激素受体超家族成员,主要作用是调节脂质代谢,对干细胞向肝样细胞分化也有调控作用。2014年,Chen等[21]将NR1H3导入干细胞细胞时观察到,这些细胞的尿素合成及细胞色素氧化酶P450活性较对照组有明显提高。与HNF-4α高表达细胞相比,NR1H3有类似的促进细胞分化及成熟作用(88.9%);但当酶解掉HNF-4α启动子-1 000～500碱基时,其活性完全消失,增强细胞分化的作用也消失。说明,NR1H3、HNF-4α在调控胚胎干细胞分化中是相互促进的关系。

可见,细胞因子在调节干细胞分化过程中在不同的环节发挥作用,其中不同的细胞因子可能有着相互关联并发挥促进细胞分化的作用。

2.3 细胞形态及极性

多细胞生物通过不对称分裂实现不同细胞极性及细胞功能。关于细胞极性,最早于19世纪初被提出,后来研究主要集中于果蝇神经干细胞的研究。2012年,Hua等[22]在研究胎肝细胞分化过程中发现,细胞极性转变对细胞生命活动有重要意义。该实验小组对人来源胎肝细胞进行两阶段培养,第一阶段通过HGF作用使胎肝细胞表现简单极性,如细胞间紧密连接(tight jounctions,TJs),这与先前的研究结果一致;第二阶段是HGF联合DEX及OSM共同刺激干细胞分化,最终观察到干细胞有肝细胞典型的多边形态包括核仁及细胞内微管结构,并通过基因本体论(gene ontology,GO)分析将不同分化阶段的不同功能相关基因分成3个基因单元:(1)上皮细胞顶端/底极性构建基因,涉及上调基因有PTK7、PRKCI及PARD3。(2)有丝分裂纺锤丝取向基因,上调的基因有KNTC2、CENPA及CCDC99。(3)细胞骨架组织形成及维持相关基因CAP2、DOCK2及NDE1。干细胞分化过程中细胞形态及极性形成涉及诸多环节,上述基因对干细胞分化中形态及极性的形成具有重要作用。

2.4 外源诱导分化剂

一般在培养肝干细胞过程中更多考虑的是用细胞因子或使某特定基因高表达来诱导或提高分化效率。2014年日本学者Kondo等[23]在研究人多能干细胞分化为肝样细胞,通过向实验组加入丙戊酸,继而检测ALB、AFP等水平时发现,蛋白水平与对照组相比有明显提升。2013年Dong等[24]在研究骨髓间充质干细胞分化时也得出同样结论,其具体机制可能是丙戊酸是组蛋白脱乙酰酶抑制剂,与改变分化相关基因产物乙酰化状态有关。说明丙戊酸可促进干细胞分化及实现肝样细胞功能。

2015年,Möbus等[25]报道,在小鼠胚胎干细胞分化过程中,miR-199a-5p抑制剂不仅在细胞形态、更重要在细胞功能上加速干细胞向肝样细胞分化,这可能与miR-199a-5p降低分化过程中染色体稳定性而其抑制剂起稳定染色体作用有关。2015年,Yin等[26]在研究脂肪组织来源干细胞(AT-MSCs)分化为肝样细胞过程中发现,曲古菌素A(TSA)可促进AT-MSCs分化、成熟,促进干细胞向内胚层细胞分化进而分化为肝样细胞,从而表达更多成熟肝细胞表达的蛋白。

表1 肝干细胞常见调控机制

3 现存问题与展望

如何促进干细胞分化为肝样细胞主要面临技术和伦理两个方面的问题。在技术上,干细胞有较高分化潜能,但细胞分化过程错综复杂,涉及不同基因表达和微环境变化,分化随机性较强,分化方向存在不确定性,包括在分化中不能完全避免畸胎瘤或肝细胞肿瘤形成,涉及干细胞移植效率和安全性问题。由于胎肝细胞和胚胎干细胞均取自胚胎,胚胎相关干细胞临床研究涉及难以解决的伦理问题。尽管目前干细胞研究如火如荼,涉及各脏器多种疾病,甚至遍地开花,但缺乏一套令人信服的理论和实践体系。干细胞分化为肝样细胞的安全性、稳定性、高效性,都是亟待解决的关键问题。因此,真正走向临床并广泛应用还有很长的路要走。但一项新理论的发现和新技术的运用从来都不是一帆风顺的,尤其是划时代意义的革新或者革命。随着对干细胞研究的日渐深入,相信会找到干细胞分化为肝细胞更可靠的诱导方法,使肝病患者从中获益,从而推动肝干细胞移植医学的进步。

[1] Duan BW,Lu SC,Wang ML,et al.Liver transplantation in acute-on-chronic liver failure patients with high model for end-stage liver disease (MELD) scores:a single center experience of 100 consecutive cases[J].J Surg Res,2013,183(2):936-943.

[2] 郭晓霞,贺福初.胚胎干细胞的研究与利用[J].科学通报,2000,45(5):467-474.

[3] 赵紫敬,程黎明.诱导性多功能干细胞在脊髓损伤干细胞治疗中的研究进展[J].外科研究与新技术,2013,2(1):52-58.

[4] Girlovanu M,Susman S,Soritau O,et al.Stem cells-biological update and cell therapy progress[J].Clin Med,2015,88(3):265-271.

[5] 张鹏,朱晓峰,焦兴元.卵圆细胞的生物学特性及其与原发性肝癌的关系[J].中国普外基础与临床杂志,2015,22(4):494-498.

[6] 杨志云,王宪波,殷飞,等.肝卵圆细胞——肝干细胞研究进展[J].中国肝脏病杂志(电子版),2010,2(1):52-55.

[7] Li Y,Zhao LJ,Xia FZ,et al.Transdifferentiation of hepatic oval cells into pancreatic islet beta-cells[J].Front Biosci (Landmark Ed),2012,17(1):2391-2395.

[8] Wang W,Du Z,Yan J,et al.Mesenchymal stem cells promote liver regeneration and prolong survival in small-for-size liver grafts:involvement of C-Jun N-terminal kinase,cyclin D1,and NF-kappaB[J].PLoS One,2014,9(12):e112532.

[9] Ivey KN,Muth A,Arnold J,et al.MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells[J].Cell Stem Cell,2008,2(3):219-229.

[10] Cui L,Shi Y,Zhou X,et al.A set of microRNAs mediate direct conversion of human umbilical cord lining-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes[J].Cell Death Dis,2013,4(11):e918.

[11] Cui L,Zhou X,Li J,et al.Dynamic microRNA profiles of hepatic differentiated human umbilical cord lining-derived mesenchymal stem cells[J].PLoS One.2012,7(9):e44737.

[12] Thakral S,Ghoshal K.miR-122 is a unique molecule with great potential in diagnosis,prognosis of liver disease,and therapy both as miRNA mimic and antimir[J].Curr Gene Ther,2015,15(2):142-150.

[13] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9):735-739.

[14] Doddapaneni R,Chawla YK,Das A,et al.Overexpression of microRNA-122 enhances in vitro hepatic differentiation of fetal liver-derived stem/progenitor cells[J].J Cell Biochem,2013,114(7):1575-1583.

[15] Chien Y,Chang YL,Chien CS,et al.Synergistic effects of carboxymethyl-hexanoyl chitosan,cationic polyurethane-short branch PEI in miR122 gene delivery:accelerated differentiation of iPSCs into mature hepatocyte-like cells and improved stem cell therapy in a hepatic failure model[J].Acta Biomater,2015,13(2):228-244.

[16] Davoodian N,Lotfi AS,Soleimani M,et al.MicroRNA-122overexpression promotes hepatic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells[J].J Cell Biochem.2014,115(9):1582-1593.

[17] Yahoo N,Pournasr B,Rostamzadeh J,et al.Forced expression of Hnf4a induces hepatic gene activation through directed differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,476(4):313-318.

[18] Laudes M.Role of WNT signalling in the determination of human mesenchymal stem cells into preadipocytes[J].J Mol Endocrinol,2011,46(2):R65-72.

[19] Su N,Thiaville MM,Awad K,et al.Protein or amino acid deprivation differentially regulates the hepatic forkhead box protein A (FOXA) genes through an activating transcription factor-4-independent pathway[J].Hepatology,2009,50(1):282-290.

[20] Liu T,Zhang S,Xiang D,et al.Induction of hepatocyte-like cells from mouse embryonic stem cells by lentivirus-mediated constitutive expression of Foxa2/Hnf4a[J].J Cell Biochem,2013,114(11):2531-2541.

[21] Chen KT,Pernelle K,Tsai YH,et al.,Liver X receptor alpha (LXRalpha/NR1H3) regulates differentiation of hepatocyte-like cells via reciprocal regulation of HNF4alpha[J].J Hepatol,2014,61(6):1276-1286.

[22] Hua M,Zhang W,Li W,et al.Molecular mechanisms regulating the establishment of hepatocyte polarity during human hepatic progenitor cell differentiation into a functional hepatocyte-like phenotype[J].J Cell Sci,2012,125(Pt 23):5800-5810.

[23] Kondo Y,Iwao T,Yoshihashi S,et al.Histone deacetylase inhibitor valproic acid promotes the differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells[J].PLoS One,2014,9(8):e104010.

[24] Dong X,Pan R,Zhang H,et al.Modification of histone acetylation facilitates hepatic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].PLoS One,2013,8(5):e63405.

[25] Möbus S,Yang D,Yuan Q,et al.MicroRNA-199a-5p inhibition enhances the liver repopulation ability of human embryonic stem cell-derived hepatic cells[J].J Hepatol,2015,62(1):101-110.

[26] Yin L,Zhu Y,Yang J,et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiated into hepatocyte-like cellsinvivoandinvitro[J].Mol Med Rep,2015,11(3):1722-1732.

Progressonregulatorymechanismofstemcellsdifferentiatedintohepatocyte-likecells

XIAOShuai,SHIBaomin

DepartmentofGeneralSurgery,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200065,China

Stem cells have the potential for self-renewal and multi-directional differentiation.Experiments have proven that stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells under certain conditions,with hepatocyte markers and functions.Liver transplantation is the only effective and curative way for end-stage liver disease,but is limited by a shortage of donor organs,high costs of surgery,long-term immune therapy,and so on.In light of that,stem cells are of potential application value in the treatment of end-stage liver disease.This review focused on the regulatory mechanisms of stem cells differentiated into hepatocyte-like cells.

Stem cells; Differentiation; Regulatory mechanism; Hepatocyte-like cells

R329.2+1

A

2095-378X(2017)03-0189-04

2017-05-06)

肖 帅(1989—),男,同济大学医学院外科学硕士在读

施宝民,电子信箱:baominsph@163.com

10.3969/j.issn.2095-378X.2017.03.013