载黑色素脂质纳泡的制备及体外多模态显像实验研究

张 亮，姚元志，杨 珂，王 颖，曹 阳，汪朝霞，王志刚，李崇雁，王 冬*

(1.重庆医科大学附属儿童医院超声科 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014；2.重庆医科大学超声分子影像研究所 重庆市超声分子影像重点实验室，重庆 400010；3.重庆市肿瘤医院超声科 重庆市肿瘤研究所 重庆市癌症中心，重庆 400030；4.重庆医科大学超声医学工程研究所，重庆 400016)

载黑色素脂质纳泡的制备及体外多模态显像实验研究

张 亮1,2，姚元志3，杨 珂1,2，王 颖1,2，曹 阳2，汪朝霞1，王志刚2，李崇雁4，王 冬1,2*

(1.重庆医科大学附属儿童医院超声科 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014；2.重庆医科大学超声分子影像研究所 重庆市超声分子影像重点实验室，重庆 400010；3.重庆市肿瘤医院超声科 重庆市肿瘤研究所 重庆市癌症中心，重庆 400030；4.重庆医科大学超声医学工程研究所，重庆 400016)

目的制备一种包载黑色素的多模态脂质纳泡(MNBs)造影剂，观察其体外超声、光声、MR显影效果。方法采用三氯甲烷注入—冷冻干燥—全氟丙烷充气法制备MNBs和普通脂质纳泡(NBs)，检测MNBs的一般特性(形态、粒径、黑色素装载量、稳定性)，对不同浓度MNBs进行体外超声、光声、MR成像并进行定量对比分析。结果MNBs形态规则，粒径分布均匀，透射电镜显示MNBs成功包裹黑色素颗粒。黑色素的载药量为90.53 μg/mg。体外显影实验示随MNBs和NBs浓度的增加，超声造影效果明显增强，MNBs和NBs的超声造影表现无明显差异，相对信号强度差异无统计学意义(P>0.05)；随MNBs浓度的增加，光声和MRI显影效果增强，NBs无光声和MRI显影效果。结论成功制备出一种包载黑色素的多模态脂质纳泡造影剂，可明显增强超声、光声、MR显影效果。

脂质纳泡；黑色素；超声检查；光声成像；磁共振成像

目前，由于单一模式的影像学成像不能全面地获取病灶信息，为获取更加全面、丰富、精准的影像信息，提高疾病的检出率，多种影像成像方法的融合成为当前影像技术的发展趋势之一[1]。黑色素是一种生物源性的多聚烃类化合物，可作为光声成像和MR成像的理想靶标，与传统多模态成像介质相比，黑色素具有良好的生物相容性和生物降解能力[2-5]。超声、光声、MR成像技术均是生物医学领域的无创成像技术。本研究将具备增强光声成像和MR成像功能的黑色素包裹在具有超声造影功能的脂质纳泡(NBs)中，构建一种具有超声/光声/MR多模态显像功能的脂质纳泡造影剂(MNBs)，评估其体外超声、光声、MRI效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000(DSPE-mPEG2000)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、胆固醇、黑色素(Sigma公司)；全氟丙烷(C3F8，天津核工业理化工程研究所)；超声破碎仪(VCX-130，Sonic公司)；XL2020声振仪(Heat System Inc)；Malvern激光粒径检测仪(美国Zetasize公司)；UV-2500紫外-可见分光光度计(Shimadzu公司，日本)；正置光学显微镜(Olympus公司，日本)；冷冻干燥机；细胞计数板；Esaote Mylab90彩色超声诊断仪；Vevo®LAZR光声成像系统；DFY-Ⅱ型超声图像定量分析诊断仪(重庆医科大学超声影像学研究所)；布鲁克7.0T小动物磁共振成像仪。

1.2 MNBs的制备 采用三氯甲烷注入—冷冻干燥—全氟丙烷充气法制备MNBs，将10 mg DSPC、5 mg DSPE-mPEG2000、3 mg DPPG和3 mg胆固醇溶解于10 ml CHCl3中，超声破碎仪声振5 min，使脂质充分溶解于CHCl3。将2 mg黑色素粉末加入2 ml NaOH(pH=12.9)中至其完全溶解，然后装入透析袋(分子量12 000 kD)，用HCl (0.01 mol/L)将其pH调至7.4，获得黑色素溶液。将黑色素溶液预热至65℃，在65℃恒温磁珠搅拌下逐滴加入脂质CHCl3溶液，控制滴速为0.2 ml/min，随着CHCl3的挥发，由于溶解在有机溶剂的磷脂特殊的自组装特性，将黑色素溶液包裹，形成包载黑色素溶液的脂质体微球。然后声振(100 W)2 min使脂质体微球变小，再用超滤离心管(MWCO=100 kDa)高速离心3次(10 000转/分，20 min)去除未包载的黑色素溶液，收集脂质体，冷冻干燥后充入C3F8，即获得MNBs冻干粉。在制备过程中，用等量的双蒸水代替黑色素溶液，即可制得NBs冻干粉。

1.3 MNBs一般性质检测 取少量MNBs溶解于双蒸水，透射电镜观察其形态、分布，激光粒径检测仪检测其粒径大小和分布。采用电子天平称取MNBs冻干粉的质量。用紫外-可见光分光光度法测定不同浓度的黑色素光吸收特性、测定MNBs中的黑色素含量。配置3 mg/ml的MNBs的溶液，于0、6、12、24 h测量其浓度(利用血球计数板计数)、粒径、分散性。

1.4 MNBs体外超声显像 将不同浓度MNBs、NBs的PBS溶液(1、2、3 mg/ml)和PBS加入自制的凝胶模型中，采用EC123高频线阵探头，于谐波模式下观察体外超声显影情况，并采用DFY-Ⅱ型超声图像定量分析诊断仪分析各靶区相对信号强度，即造影剂声强与PBS声强之比。

1.5 MNBs体外光声显像 将2 mg/ml MNBs的PBS溶液加入自制的凝胶模型，光声成像参数设定：Priority 98%，Brightness 50，Contrast 50，PA Gain 40 dB，2D Gain 18 dB，Frequency 21 MHz。采用波长680～970 nm脉冲激光辐照，以5 nm波长幅度递增，采集光声信号，绘制MNBs的吸收光谱曲线。

将不同浓度MNBs的PBS溶液(1、2、3 mg/ml)注入凝胶空洞，700 nm波长的脉冲激光辐照，采集不同浓度下光声图像并记录光声信号值。

1.6 MNBs体外磁共振显像 配制0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/ml MNBs的PBS溶液作为实验组Ⅲ～Ⅶ，取10 mg/ml NBs和PBS作为对照组Ⅰ、Ⅱ。采用布鲁克7.0T小动物MR成像仪行T1WI扫描和T1 mapping扫描。T1WI参数：TR 600 ms，TE 6 ms，层厚1 mm，FOV 40 mm×40 mm。T1 mapping扫描参数：TR 400、800、1 200、2 400、3 600、4 800 ms，TE 8.0 ms，层厚1 mm，FOV 40 mm×40 mm。沿各管内径勾画ROI，测得信号强度(signal intensity, SI)和T1值，计算1/T1。

图1 MNBs造影剂光学显微镜图(A)、透射电镜图(B)、粒径分布图(C)及黑色素紫外-可见光吸收光谱图(D)

图2 MNBs体外超声显像 A.不同浓度载黑色素脂质纳泡和空白脂质纳泡谐波显像; B.MNBs和NBs溶液相对信号强度值

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。对各参数均行正态性检验，计量资料以±s表示，不同浓度MNBs时，光声信号值、1/T1的比较采用单因素方差分析；MNBs浓度和1/T1进行Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MNBs一般性质 制备的MNBs外观呈棕色粉末，在水溶液中为均匀的乳液。光学显微镜观察纳泡呈圆形，大小均一，分散性好(图1A)。透射电镜见MNBs形态规则，内见大小均一的高密度颗粒(图1B)。激光粒径检测仪测其分散性好，平均粒径(247.30±65.20)nm(图1C)。紫外—可见光吸收光谱波长230～800 nm增大时，黑色素溶液的吸收值逐渐降低(图1D)。将波长设定为430 nm，选择吸光度在0.2～0.8范围内的点绘制标准曲线，回归方程为Y=0.015 50X+0.006 027(R2=0.998 8)；根据标准曲线回归方程计算黑色素的装载量为90.53 μg/mg。0、6、12、24 h时，MNBs溶液的浓度和粒径变化不大，各时间点分散性良好。

2.2 MNBs体外超声显像 体外超声显像示，MNBs和NBs溶液均呈高回声(图2A)，而PBS溶液呈无回声；MNBs和NBs溶液回声强度随造影剂浓度的增加而提高，相同浓度的MNBs和NBs溶液的相对信号强度差异无统计学意义(P>0.05)，如图2B。

2.3 MNBs体外光声显像 在680～970 nm激光发射波长下，MNBs造影剂均可表现出光声信号，700 nm处有最大吸收峰，从700 nm开始，随脉冲激光波长的增加，MNBs造影剂的光声信号逐渐降低(图3A)。700 nm激发波长下，随MNBs造影剂溶液浓度的增加，其光声信号也增强(图3B、3C)。NBs造影剂无明显光声显像效果(图3C)。

2.4 MNBs体外磁共振显像 体外磁共振显像示，NBs和PBS在T1WI呈低信号，MNBs呈高信号(图4A)，MNBs浓度和1/T1线性回归方程为：Y=0.052 2X+0.348 3(R2=0.991，P<0.05；图4B)，信号强度随造影剂浓度的增加而增加(图4C)。

图3 MNBs体外光声显像 A.2 mg/ml MNBs在680～970 nm波长内光声信号值变化; B.不同浓度的MNBs和NBs(3 mg/ml)造影剂光声显像; C.不同浓度的MNBs定量光声信号强度

图4 MNBs体外MR显像 A.对照组(Ⅰ、Ⅱ)和实验组(Ⅲ～Ⅶ)T1WI图像; B.MNBs浓度与1/T1值的线性相关图; C.对照组(Ⅰ、Ⅱ)、实验组(Ⅲ～Ⅶ)的信号强度

3 讨论

目前，分子影像在疾病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用，为获取丰富、准确的影像信息，笔者制备了一种包载黑色素的脂质纳泡造影剂，同时具备超声、光声和MR造影效果。脂质纳泡造影剂因粒径小、穿透力强、稳定性较高、血液循环时间长等优点，作为超声分子探针、药物及基因载体等成为研究热点[6-7]。多模态成像介质如金纳米材料[8]，碳纳米材料[9]和染料[10]是目前最常见的光声成像造影剂，虽然临床安全性已获得FDA的认证，但其远期安全性和体内清除仍有待进一步研究。黑色素广泛存在于动物、植物及微生物，是一种多聚芳香烃类化合物，含较多的苯环结构，含很多自由基和不成对电子[11]，由于其高度的共轭效应，在广阔的光谱区内均具有强烈的光吸收能力，也具有抗辐射、抗氧化、抗病毒、抗衰老及免疫功能，因此其成为各领域的研究热点[12-14]。有研究[12]表明，黑色素可提高光声成像的显像效果，将黑色素包被于白蛋白内，发现可明显增强光声信号。Stritzker等[4]将黑色素基因插入溶瘤牛痘病毒株的基因组中，通过黑色素基因表达产生的黑色素作为诊断及治疗的介质，在未添加任何底物的情况下即可进行深部组织光声显像及MR显像。表明黑色素在MRI上具有特征性的短T1信号，可增强T1WI成像。具有超声显像功能的脂质纳泡造影剂包裹黑色素颗粒形成的MNBs同时具备增强超声显影、光声成像、MR成像的功能。

本实验选择具有良好生物安全性的磷脂作为壳材，C3F8气体及生物源性的黑色素作为内核。磷脂是生物膜的重要组分，经各种磷脂酶分解代谢，其代谢产物参与糖代谢、β氧化等[15]。人体大部分黑色素随表皮角质层细胞的脱落外，也有部分黑色素受角朊细胞内溶酶体作用被降解，被吞噬细胞所吞噬降解，或在血液循环中分解经肾排出[16]。少量C3F8气体可经肺排出。因此，MNBs具有高度的生物相容性和生物降解能力，安全性高。本实验所制备的MNBs造影剂大小均一，粒径较小，分散性良好；透射电镜显示脂质体成功包载了黑色素。将本实验所制备的MNBs保存于密封的充满全氟丙烷气体的玻璃瓶，可长期保存。MNBs分散于水溶液24 h内其数目、粒径无明显改变，稳定性好；体外超声实验显示，MNBs和NBs均具有良好的超声显影效果，表明MNBs和NBs内成功包载了全氟丙烷气体；MNBs和NBs的回声强度无明显差异，提示包载的黑色素对MNBs的超声显影无明显影响；体外光声显影实验结果显示，MNBs在700～970 nm波长的激光作用下，随着波长的增加，光声信号逐渐减弱；在700 nm波长的激光作用下，随MNBs浓度的增加，光声信号也随之增强,而NBs在激光作用下无光声信号，表明光声信号的产生源于黑色素而非脂质纳泡和全氟丙烷；体外MRI结果显示MNBs可显著增强T1WI而NBs不能增强T1WI，表明T1WI信号的增强与黑色素密切相关。

本实验的不足：未对黑色素的载入量进行优化，黑色素载入量越高，光声成像和MRI效果越好，但在MNBs体积一定的情况下，全氟丙烷气体的含量越少，超声造影效果越差。将在后续试验中制备不同大小的载不同质量黑色素纳泡，评估其多模态造影效果。

总之，本实验成功制备了包载黑色素的多模态脂质纳泡造影剂MNBs，其具备超声造影、光声成像和MRI显像功能；该造影剂的成分为生物来源的黑色素和磷脂，生物相容性好，安全性高。

[1] 王志刚.多模态超声造影剂研究进展.中国医学影像技术,2010,26(增刊):91-94.

[2] Wilson K, Homan K, Emelianov S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nat Commun, 2012,3:618.

[3] Jathoul AP, Laufer J, Ogunlade O, et al. Deep in vivo photoacoustic imaging of mammalian tissues using a tyrosinase-based genetic reporter. Nat Photon, 2015,9(4):239-246.

[4] Stritzker J, Kirscher L, Scadeng M, et al. Vaccinia virus-mediated melanin production allows MR and optoacoustic deep tissue imaging and laser-induced thermotherapy of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(9):3316-3320.

[5] Zhang R, Fan Q, Yang M, et al. Engineering melanin nanoparticles as an efficient drug-delivery system for imaging-guided chemotherapy. Adv Mater, 2015,27(34):5063-5069.

[6] 姚元志,王志刚,王冬,等.对比观察脂质纳泡与微泡在高强度聚焦超声消融兔肝中的增效作用.中国介入影像与治疗学,2015,12(8):493-498.

[7] Yang HL, Cai WB, Xu L, et al. Nanobubble-affibody: Novel ultrasound contrast agents for targeted molecular ultrasound imaging of tumor. Biomaterials, 2015,37:279-288.

[8] 夏琼,冉海涛,王志刚,等.VCAM-1靶向双模态光声/超声纳米级分子探针的制备及其体外寻靶实验.中国医学影像技术,2016,32(3):333-337.

[9] Jian J, Liu C, Gong Y, et al. India ink incorporated multifunctional phase-transitionnanodroplets for photoacoustic/ultrasound dual-modality imaging and photoacoustic effect based tumor therapy. Theranostics, 2014,4(10):1026-1038.

[10] 陈澄,宫玉萍,王志刚,等.制备包裹吲哚菁绿和液态氟碳的纳米级双模态造影剂.中国医学影像技术,2015,31(2):186-190.

[11] Butler MJ, Day AW. Fungalmelanins: A review. Can J Microbiol, 1998,44(12):1115-1136.

[12] Sim C, Kim H, Moon H, et al. Photoacoustic-based nanomedicine for cancer diagnosis and therapy. J Control Release, 2015,203:118-125.

[13] Fan Q, Cheng K, Hu X, et al. Transferring biomarker into molecular probe: Melanin nanoparticle as a naturally active platform for multimodality imaging. J Am Chem Soc, 2014,136(43):15185-15194.

[14] Huang S, Pan Y, Gan D, et al. Antioxidant activities and UV-protective properties of melanin from the berry of Cinnamomumburmannii and Osmanthus fragrans. Med Chem Res, 2011,20(4):475-481.

[15] 李斯.试论磷脂代谢的问题探究.生物技术世界,2016,1:238.

[16] ElObeid AS, Kamal-Eldin A, Abdelhalim MAK, et al. Pharmacological properties of melanin and its function in health. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2017,120(6):515-522.

消 息

《中国医学影像技术》作者投稿请登录本刊网站(www.cjmit.com)主页，点击左上角“作者登录”进入，第一次投稿需完成作者注册；专家审稿请点击“审稿登录”进入。

为了便于广大作者、读者查阅本刊文献，本站提供从1985年起的过刊和现刊的全文检索。

Preparationofmelanin-basedlipidnanobubblesforenhancingmultimodalimaginginvitro

ZHANGLiang1,2,YAOYuanzhi3,YANGKe1,2,WANGYing1,2,CAOYang2,WANGZhaoxia1,WANGZhigang2,LIChongyan4,WANGDong1,2*
(1.DepartmentofUltrasound,Children'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,ChinaInternationalScienceandTechnologyCooperationBaseofChildDevelopment,ChongqingKeyLaboratoryofPediatrics,Chongqing400014,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity，ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundMolecularImaging,Chongqing400010,China; 3.DepartmentofUltrasound,ChongqingCancerHospital,ChongqingCancerInstitute,ChongqingCancerCenter,Chongqing400030,China; 4.InstituteofUltrasonicEngineeringinMedicalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.)

ObjectiveTo prepare multi-modality melanin-based lipid nanobubbles (MNBs) contrast agents, and to investigate their manifestations of ultrasound (US), photoacoustic (PA) and MRI in vitro.MethodsMNBs and lipid nanobubbles (NBs) were prepared with the method of CHCl3-injection, freeze-drying and C3F8-inflation. The characteristics (shape, grain diameter, loading capacity of melanin and stability) of MNBs were obseved. US, PA and MRI were detected in vitro and the images were quantitatively analyzed.ResultsMNBs presented with homogenized size distribution, and transmission electron microscope (TEM) images demonstrated that the melanin particles were successfully entrapped into nanobubbles. Meanwhile, the loading capacity of melanin was 90.53 μg/mg. US signal increased in vitro with the rise of MNBs and NBs concentration. The ultrasonic manifestations of MNBs and NBs were the same, and the relative signal enhancement had no significant difference (P>0.05). With the increased concentration of MNBs, the PA and MRI signals were stronger, but NBs showed no evident enhancement.ConclusionMulti-modality MNBs contrast agents are prepared successfully, which can enhance US, PA and MR imaging.

Lipid nanobubbles; Melanin; Ultrasonography; Photoacoustic imaging; Magnetic resonance imaging

10.13929/j.1003-3289.201704096

R445

A

1003-3289(2017)10-1458-05

国家自然科学基金项目(81571688、81401503、81771845)、中国博士后特别资助项目(2015T80963)、重庆市博士后科研项目特别资助(Xm2014052、Xm2015089)。

张亮(1990—)，男，湖北麻城人，在读硕士。研究方向：超声分子显像与治疗研究。E-mail: zhangliangcq338@163.com

王冬，重庆医科大学附属儿童医院超声科 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室，400014;重庆医科大学超声分子影像研究所 重庆市超声分子影像重点实验室，400010。E-mail: wang57554@163.com

2017-04-19

2017-08-31