三种常规方法检测血清胆红素结果的可比性和偏倚评估

王 杨，谷冬梅，陈京山，胡志东*

(天津医科大学总医院 1.医学检验科，2.健康事业部，天津300052)

三种常规方法检测血清胆红素结果的可比性和偏倚评估

王 杨1，谷冬梅1，陈京山2，胡志东1*

(天津医科大学总医院 1.医学检验科，2.健康事业部，天津300052)

目的本研究对三种常规方法(重氮法、钒酸盐法和干化学法)检测血清胆红素进行检测结果的可比性及偏倚评估分析，为实验室检测结果一致性及标准化提供实验数据支持。方法按照美国国家临床实验室标准委员会EP9-A文件方案，以重氮法为比对方法，钒酸盐法和干化学法为待评方法，分别对40例新鲜血清样本进行平行检测，并对检测结果进行线性回归分析、计算医学决定水平处的方法间预期偏倚，以临床化学检验常规项目分析质量指标(WS/T403-2012)允许总误差范围的1/2为判断标准，判断偏倚的临床可接受性。结果总胆红素检测钒酸盐法和干化学法与重氮法的回归方程分别为：y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5；该两种方法在医学决定值水平处(25、50和340 μmol/L)与重氮法的预期偏倚分别为：-0.80、-2.96和-28.08以及-2.39、-6.70和-56.76。直接胆红素检测钒酸盐法与重氮法检测结果回归方程为：y=0.8274x+ 1.9252，r2=0.997 8；两种方法在医学决定值水平处(6、35.5 μmol/L)的预期偏倚分别为：0.98和-4.21。结论总胆红素与直接胆红素不同方法间均具有良好的相关性(r2均大于0.95)，但不同方法间的预期偏倚随医学决定值水平的增高显著增加。与重氮法检测结果相比，钒酸盐法检测总胆红素预期偏倚可接受；干化学法检测总胆红素与钒酸盐法检测直接胆红素结果则仅有较低医学决定值水平预期偏倚可接受。

方法比对；偏倚评估；总胆红素；直接胆红素

(ChinJLabDiagn,2017,21:1744)

临床实验室常用两种以上不同检测系统对相同检测项目进行分析，如何保障其检测结果具有可比性和一致性，已成为重要课题[1，2]。血清总胆红素有助于临床医生判断患者黄疸程度及其类型，是美国临床病理学会(CAP)全球室间质量调查中问题最大的项目之一[3]。本研究依据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的“用患者标本进行方法比对及偏倚评估-批准指南”EP9-A文件[5]的要求，对本实验室内重氮法、钒酸盐法和干化学法三种方法检测总胆红素(T-BIL)和直接胆红素(D-BIL)的结果进行方法学比对及预期偏倚评估，探寻提高检验结果可比性的方法。

1 材料与方法

1.1检测系统的组成

1.1.1重氮法 T-BIL试剂盒(Roche)，D-BIL试剂盒(Roche)。仪器为罗氏DPP Modular全自动生化分析仪(D模块)。

1.1.2钒酸盐法 T-BIL试剂盒(日本和光)；D-BIL试剂盒(日本和光)。仪器为罗氏DPP Modular全自动生化分析仪(P模块)开放通道。

1.1.3干化学法 T-BIL测定干片(强生)。仪器为强生Viros5600干化学生化分析仪。

1.2标准品和质控品

1.2.1重氮法和钒酸盐法 Roche c.f.a.s 校准品(批号177963)；Roche PCCC系列质控品(批号181739/181775)。

1.2.2干化学法 强生校准品(批号0414)；强生质控品(批号A3823/Y3571)。

1.3样品的选择和处理

连续5天每天8例收集本院患者共计40例无溶血、无严重脂血的新鲜血清，T-BIL浓度在3.9-440.9 μmol/L之间。浓度分布参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)EP9-A方案[5](表1)。

表1 方法学比对实验中总胆红素浓度分布

1.4测定方法

1.4.1精密度的评估 根据CLSI EP-15A要求，选择在血清T-BIL医学决定水平处(25 μmmol/L,50 μmmol/L和340 μmmol/L)的血清样本进行三种常规方法批内和批间不精密度测定，分5天完成，每天每个样本各测定5次。

1.4.2样品的测定及结果的收集 连续5天每天8份分别使用三种方法对同一样本进行双份测定；全部标本均应在两小时内测定完毕。在样本的双份测定中，指定第一次测定顺序，按反向顺序检测第二次。

1.4.3比对方法的确定 重氮法作为国际临床化学家联合会(IFCC)和临床实验室标准化协会推荐的参考方法，在本实验室参加全国室间质评，成绩优异，其精密度较好(表2)，故以其作为比对方法，以钒酸盐法和干化学法作为待评方法。

1.5统计学分析

两种诊断试剂的测定结果按照CLSI EP9-A[5]指南要求进行统计学分析，用Microsoft Excel 2007 做出散点图(图1)和偏倚图(图2)，计算相关性统计分析并给出线性回归方程Y=bX+a，其中钒酸盐法和干化学法为实验方法(Y)，重氮法为比对方法(X)，计算待评方法(Y)与比较方法(X)之间的预期偏倚。

按EP9-A[5]文件进行三种方法测定值之间的离群值检查并判断。比对方法(X) 测定范围的检验，X的分布范围是否合适，可用相关系数(r)作粗略估计，如r>0.975或r2>0.95，则认为X取值范围合适，直线回归统计的斜率和截距可靠，如r<0.975则说明实验方法的精密度较差或X取值范围不合适，直线回归统计的斜率和截距不可靠，需改善方法的精密度后重新试验。

根据其散点图(图1)使用线性回归分析来计算T-BIL和D-BIL医学决定水平(Xc)处的预期偏倚(Bc)及其95%可信区间，并与临床化学检验常规项目分析质量指标(WS/T403-2012)要求允许总误差的1/2比较。

2 结果

2.1精密度评价

重氮法、钒酸盐法和干化学法三种方法检测T-BIL在医学决定值水平(25 μmmol/L,50 μmmol/L,340 μmmol/L)的批间、批内和总CV均小于WS/T403-2012允许总误差的1/3。其中重氮法批间、批内和总CV最小，即不精密度最小，其次为钒酸盐法，干化学法不精密度稍大，但依然满足临床应用需求(5.21%<1/3*20%)(表2)。

表2 三种常规方法测定血清胆红素的精密度结果

2.2比对实验

2.2.1离群值检查 根据EP9-A文件要求，经方法内双份测定结果及方法间离群值检测，本实验三种检测体系间均无离群点。

2.2.2重氮法、钒酸盐法和干化学法检测结果散点图以及偏倚图 图1显示血清T-BIL检测钒酸盐法和干化学法与重氮法检测结果回归方程分别为：y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5。血清D-BIL检测钒酸盐法与重氮法检测结果回归方程为：y=0.827 4x+1.925 2，r2=0.997 8。r2均大于0.95，说明比对方法的检测范围足够宽，能够满足比对要求；血清胆红素取值范围内检测钒酸盐法和干化学法与重氮法检测结果之间的线性关系良好，回归统计的截距和斜率均可靠。

图2显示，血清T-BIL和D-BIL浓度在较低范围时(0-50 μmol/L)，不同方法间检测结果差异较小，在血清胆红素浓度逐渐增高时，钒酸盐法和干化学法与重氮法之间的差异随之加大。干化学方法检测血清T-BIL结果较重氮法检测结果高；钒酸盐法检测血清T-BIL和D-BIL结果较重氮法结果低。

2.3预期偏差的计算和可接受性能的评价

如表3所示：重氮法与钒酸盐法在检测血清T-BIL时，在医学决定水平处的预期偏倚小于允许偏倚，检测血清D-BIL在Xc=6 μmol/L时的预期偏倚可接受(表3)。干化学法与重氮法在检测血清T-BIL时，在Xc=25 μmol/L，两种方法检测结果之间的预期偏倚较小，可接受，但是在高值医学决定水平处(Xc=50 μmol/L和Xc=340 μmol/L)，预期偏倚大于允许偏倚，不可接受(表4)。该结果与偏倚图(图2)结果一致。

图1 重氮法、钒酸盐法和干化学法两次检测结果均值的散点图

图2 重氮法、钒酸盐法和干化学法两次检测结果均值差值的偏倚图

检测项目医学决定水平预期偏倚(95%CI)可接受偏倚结果评价T-BIL(μmol/L)25-0.80(-1.59,-0.01)2.5接受50-2.96(-3.70,-2.22)5接受340-28.08(-30.34,-25.82)34接受D-BIL(μmol/L)60.98(0.13,1.64)0.6接受35.5-4.21(-4.89,-3.53)3.6不接受

表4 重氮法与干化学法医学决定水平处预期偏倚

3 讨论

本研究表明：重氮法、钒酸盐法和干化学分别测定血清T-BIL和D-BIL，不同方法间检测结果均具有良好的相关性(图1)，与文献报道一致[4,7,8]。本实验室干化学测定血清T-BIL结果普遍高于重氮法结果，虽然有良好相关性，在低浓度医学决定水平处(Xc=25 μmol/L)，两种方法检测结果之间的预期偏倚较小，可接受； 随血清T-BIL浓度逐渐增高时，两种检测结果之间的偏倚随之增加，超出允许范围，不具备可比性(表4)。干化学与湿化学检测结果的不可比性的现象具有普遍性，据Hongwei Fu等[1]的报道显示ALT，AST和ALP等指标用干化学和湿化学分别检测时，在部分医学决定水平处相对偏倚可达到30%以上。本研究在Xc=340 μmol/L 水平处，两者间相对偏差亦达到了16.69%。分析可能原因为：同为重氮法反应原理，但湿化学测定时，吸光度变化与测定物质浓度的变化遵循郎伯比尔定律；浓度标准曲线为直线；而干化学法测定，吸光度随物质浓度变化遵循William klapper定律，浓度标准曲线为曲线。浓度标准曲线的不同类型，决定了两种方法只能在某段浓度范围内具有可比性，亦不可能通过数学因子校正的方式来实现两种方法在高中低三个医学决定水平处均做到检测结果的一致性。由本研究结果亦可看出，在正常参考区间的上线浓度水平附近时两种方法有很好的一致性，这样能够充分保障两种方法对黄疸的临床诊断判断的一致性，当临床治疗连续监测血清胆红素水平变化时，需采用同一种方法进行比较，避免不同实验方法的交叉检测。另外一个原因为两种检测系统的溯源不同，本研究使用的罗氏的重氮法溯源到Doumas参考方法，vitro5600干化学溯源到J-G重氮法(参考方法)，参考物质为NIST SRM 916a[National Institute of Standard Technology,(美国)国家标准技术研究所;Standard Reference Material]。两者溯源级别都较高，所以两种系统的结果具有相关性，但是具体的参考方法不同使得两种有差异，并且随着胆红素浓度的增高，差异增大。

重氮法与钒酸盐法检测血清T-BIL时的结果在接受范围内(表3)，但是两种方法在检测D-BIL时，医学决定水平处(Xc=35.5 μmol/L)的偏倚不可接受。分析可能原因是重氮法在检测D-BIL时的溯源级别较低，只能溯源到厂家检测程序。另外，校准物之间的互通性是不同检测方法之间结果可比性的重要方面。即用两个程序测量此校准物所得结果的数字关系，与用这两个程序测量实际样品所得结果的数字关系一致。本研究中重氮法与钒酸盐法使用的相同校准物，与干化学的校准物不同。这也可能是钒酸盐法与重氮法检测T-BIL时，有较好的可比性的原因之一。李祥坤[9,10]等人的研究认为方法之间相关系数几乎均保持在0.99，各种方法之间几乎没有差异并可以相互比较结果。这种结论的得出可能源于分析样本均为低浓度D-BIL所致(0-50 μmol/L)。

综上所述，目前，实现不同检测方法之间结果的可比性还存在不少问题，需要进一步研讨解决。本研究按照EP9-A文件要求从相关性、预期偏倚评估及与临床化学检验常规项目分析质量指标(WS/T403-2012)要求允许总误差的1/2比较等方面综合分析目前常规检测血清胆红素的方法检测结果的准确性和不一致的可接受限，从不同角度评估检测结果，有利于为临床疾病诊断、疗效观察提供可靠保证。

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Evaluationthecompatibiltyandbiasesofthreeroutinemethodstodetermineserumbilirubin

WANGYang1,GUDong-mei1,CHENJing-shan2，etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine;2.HealthDepartment,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China)

ObjectiveTo investigate the comparability of three routine methods (Diazo,vanadic acid oxidation method,dry chemical method ) to determine serum bilirubin.MethodsAccording to the profile NCCLS-EP9A,vanadic acid oxidation method and dry chemical method were compared with the Diazo method.Forty test results were anylysed.ResultsThe linear regression equations for total bilirubin were:y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5,respectively.The bias in each medical decison level(25,50 and 340 μmol/L) was -0.80,-2.96 and -28.08;-2.39、-6.70 and -56.76,respectively.The linear regression equation for direct bilirubin wasy=0.827 4x+1.925 2，r2=0.997 8.The bias in each medical decison level(1、6 and 35.5 μmol/L) was 1.75,0.98 and -4.21.ConclusionBoth vanadic acid oxidation method and dry chemical method were closely correlated to the Diazo method.When the concentration increase,the correspondent prospective biase also increase.Compared with the test result of Diazo method,correspondent prospective biase of the vanadic acid oxidation method was accepted,while the dry chemical method was not.

method comparison;bias estimantion;total bilirubin;direct bilirubin

R446.11

A

2016-12-21)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1744-04

王杨(1979-),女，医学学士，主管技师，主要从事生化检验方面的研究。