蛹虫草优良菌株的筛选*

于海洋，王延锋，史 磊，王金贺，潘春磊，盛春鸽，刘姿彤，张 鹏，董雪梅

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041）

〈育种与驯化〉

蛹虫草优良菌株的筛选*

于海洋，王延锋**，史 磊，王金贺，潘春磊，盛春鸽，刘姿彤，张 鹏，董雪梅

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041）

本试验通过对8株蛹虫草菌株的菌丝生长速度、菌落平均直径、液体发酵菌丝体干重、培养周期以及子实体形态、重量、粗多糖含量的对比研究，筛选出优良的蛹虫草菌株。试验结果表明，蛹虫草菌株CC-8液体培养菌丝生物量明显高于其他菌株，子实体出草整齐均匀，出草率高，形态好，产量高，颜色为橘黄，子实体粗多糖含量高于其他菌株，表明菌株CC-8具有较高的经济价值，可以作为栽培菌种进行产业化生产。

蛹虫草；菌丝体；菌株筛选

蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Link.，又名北虫草、蛹草等，隶属真菌门（Fungi）虫草科（Cordycipitaceae） 虫草属（Cordyceps），与野生冬虫夏草同属肉座菌目（Hypocreales）[1]。蛹虫草在我国吉林省长白山以北地区以及辽宁、陕西、广西、福建等地均有发现；国外主要分布在法国、德国、英国美国以及加拿大等地[2]。蛹虫草对生长环境的要求较低，比较适合人工栽培[3]。蛹虫草含有虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶、腺苷等多种活性物质，能够抑制肿瘤细胞[4-5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抑菌[8-9]、抗疲劳[10]、提高人体免疫[11-12]等。因此，通常把蛹虫草作为冬虫夏草的理想替代产品。本文通过对实验室保藏的8株蛹虫草菌株进行培养，筛选出适合栽培的高产菌株，为生产提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

8株蛹虫草菌株（Cordyceps militaris） 分别编号为 CC-1、CC-2、CC-3、CC-4、CC-5、CC-6、CC-7、CC-8。

1.1.2 培养基

平板培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然；种子培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；发酵培养基：葡萄糖2%、蔗糖1%、蛋白胨2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，VB1微量，pH自然；固体栽培培养基：大米30 g，营养液30 mL（马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%，VB1微量）。1.1.3 试剂与仪器

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁均购于天津市化学试剂供销公司，其他试剂均为分析纯。

GP-01光照培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司；YXQ-LS-100A全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，济南来宝医疗器械有限公司；YP1201N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；101A-S型数显不锈钢电热鼓风干燥箱，上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司；HY-5回旋式振荡器，大连富森有限公司。其他试验设备为一般常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将实验室4℃保存的8株蛹虫草菌株活化后，分别转接到90 mm装有PDA培养基的平皿上，25℃恒温培养7 d备用。

1.2.2 菌丝生长速度测量和菌落形态观察

用直径8 mm打孔器取边缘菌龄相同的菌块，接种到90 mm PDA平皿中央，25℃恒温培养15 d，采用十字交叉法测量菌落平均直径，观察菌株的菌落形态、菌丝浓密，测定菌丝生长速度。每个试验重复3次。

1.2.3 液体培养

将培养完全的种子液以10%的接种量接种到装液量为100 mL的250 mL锥形瓶内，25℃、160 r·min-1振荡培养6 d，培养结束后，用3层纱布过滤菌丝，蒸馏水清洗表面后，在60℃恒温培养箱中烘干至恒重，测定菌丝生物量。

1.2.4 出草复筛试验

将发酵完全的液体菌种，无菌操作接种到已灭菌完全的500 mL装满固体培养基的罐头瓶中，每瓶接种5 mL液体菌种，置发菌室黑暗培养，经发菌、转色、诱导子实体形成、子实体长出后采收，测定子实体形态、产量等[13]。

1.2.5 子实体活性多糖测定

将蛹虫草子实体烘干至恒重，粉碎，取蛹虫草粉末，用热水浸提法提取蛹虫草粗多糖，提取时间1 h，料液比1:10，提取3次，合并提取液，加3倍体积95%乙醇于4℃冰箱放置沉淀12 h后，利用4 000 r·min-1离心机，离心5 min，得到沉淀，经丙醇、无水乙醚洗涤后冷冻干燥，采用称质量法测定多糖得率[14]。多糖得率（P） 公式为：

式中：m1表示多糖干品的质量；m2表示子实体样品的含量。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长试验结果

8株蛹虫草菌株菌丝生长速度见图1和表1。

由图1、表1可知，不同菌株的日均生长速度和菌落形态明显不同，日均生长速度范围从2.2 mm·d-1～3.9 mm·d-1；生长初期，菌丝处于适应期生长十分缓慢，后期长势明显加快。其中CC-1、CC-8菌株的菌丝生长一直缓慢，菌落形态分别为致密、白色和稀疏、浅黄；CC-2、CC-3、CC-4、CC-5、CC-7菌株日均生长速度相差不多；CC-6菌株后期菌丝生长较快，说明菌丝生长能力较强，菌落形态为致密、绒毛状、白色。

2.2 菌丝生物量测定

8株蛹虫草菌株菌丝生物量测定结果见图2。

由图2可以看出，8株蛹虫草菌株液体培养菌丝生物量范围0.27 g～0.87 g，差异较为明显。其中CC-3、CC-6菌株的菌丝生物量较小，说明液体培养菌丝生长能力较弱；CC-1、CC-2、CC-8菌株的菌丝生物量较大，其中CC-8菌株的菌丝生物量最大，CC-7次之，说明CC-7、CC-8菌株菌丝液体培养的生长能力较强。

图2 蛹虫草菌丝生物量Fig.2 Mycelium biomass of Cordyceps militaris

2.3 栽培试验

蛹虫草菌株的复筛栽培试验结果见图3和表2。

由图3、表2可以看出，CC-3菌株未长出子实体也未转色；CC-6菌株也几乎未长出子实体；CC-1、CC-2菌株长出部分子实体但子实体形态畸形且CC-2菌株第44天就不再继续生长；CC-4、CC-5、CC-7、CC-8菌株产量均较高，但CC-5菌株子实体形态畸形，参差不齐；CC-7菌株虽然产量最高，子实体形态整齐，但大多粗短形态不佳；CC-8菌株产量略低于CC-7菌株但高于CC-4菌株，子实体形态浅黄、细长且整齐，是优良菌株。

图3 不同菌株人工栽培的子实体形态Fig.3 Fruitbody morphology of different strains in artificial cultivation

2.4 粗多糖含量

8株蛹虫草菌株的复筛试验粗多糖含量见表3。

由表3可知，8株菌株粗多糖含量差异明显，其中CC-3、CC-6菌株未形成子实体，作为淘汰菌株；CC-1、CC-2菌株粗多糖含量较低；CC-4、CC-5、CC-7、CC-8菌株粗多糖含量均较高，其中CC-8菌株粗多糖含量最高，并且子实体形态细长且整齐，说明CC-8菌株最适合作为栽培菌株进行生产。

3 结论

本试验通过保藏的8株蛹虫草菌种进行菌丝体生长状态的测定、液体培养生物量积累的测定、出草试验、子实体活性多糖的测定等，确定CC-8菌株的液体发酵生物量最大，液体发酵菌丝体生长能力较强，菌株产量较高，子实体形态浅黄、细长且整齐，子实体所含虫草多糖量最高。因此，确定CC-8菌株为优良菌株。

表2 栽培试验结果Tab.2 Results of cultivation test

表3 粗多糖得率Tab.3 Polysaccharides yields

CC-1、CC-2菌株长出部分子实体，但子实体形态畸形且CC-2第44天就不再继续生长；CC-5菌株子实体形态参差不齐，有可能菌株在出草阶段培养基营养供给不充足，影响子实体生长。因此应该针对不同地域来源菌株筛选出不同培养基。CC-3、CC-6菌株菌丝生长较快，菌落形态致密，白色绒毛，说明CC-3、CC-6菌株菌丝平皿生长能力较强，但几乎未长出子实体，未能进行子实体多糖提取试验，可能是在保藏过程中菌种发生退化，菌种退化问题是蛹虫草培养过程中面临的主要问题。因此应及时进行菌种复壮或研究如何选育出高产、稳定的优良菌株。

虫草多糖可作为筛选蛹虫草优良菌株的重要指标之一，其提取方法很多。本试验通过热水浸提的方法对蛹虫草多糖进行提取，其中单糖、蛋白质、色素及鞣质等杂质也一并被提取出来，因此如何除去虫草多糖中的杂质成分获得精制多糖还有待进一步研究。

[1]戴玉成，李玉.中国六种重要药用真菌名称的说明[J].菌物学报，2011，30（4）：515-518.

[2]张园园.蛹虫草栽培关键技术研究[D].咸阳：西北农林科技大学，2013.

[3]高宇.蛹虫草固体发酵工艺及其菌质多糖的研究[D].长春：吉林农业大学，2011.

[4]卢群，罗少洪.虫草素对人肝癌Bel-7402细胞抑制及作用机制的研究[J].中国药理学通报，2011，27(10)：1477-1478.

[5]Yan WJ,Li TH,Lin QY,et al.Safety assessment of Cordyceps guangdongensis[J].Food and Chemical Toxicology,2010,48(11):3080-3084.

[6]贾俊强，沈健.蛹虫草多糖的酶法修饰及其抗氧化活性[J].食品科学，2013，34（1）：114-120.

[7]王奇.蛹虫草的生物学特性及抗衰老功效研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[8]徐德峰，孙力军.蛹虫草抑菌活性研究开发现状与发展趋势[J].食品工业科技，2012，8（26）：424-427.

[9]孟兆丽，朱凯.蛹虫草多糖抑菌及抗氧化作用研究[J].食品研究与开发，2008，9（29）：31-33.

[10]马艳，汪宇.蛹虫草口服液对小鼠耐缺氧和抗疲劳作用[J].中国药师，2012，15（10）：1375-1377.

[11]张姝，张永杰，Shrestha，等.冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望[J].菌物学报，2013，32（4）：577-597.

[12]阮元，马进川.维生素B1、B6和生长激素2，4-D对蛹虫草液体发酵虫草素产量的影响[J].菌物学报，2014，33（2）：477-482.

[13]李森柱，夏凤娜，杨小兵.蛹虫草5个选育菌株的品比试验[J].中国食用菌，2006，25（6）：15-16．

[14]Wang Qi,Li Hui,Chen Tingting.Yield,polysaccharides content and antio xidantproperties of Pleurotus abalonus and Pleurotus geesteranus produced on asparag us straw assubstrate[J].Scientia Horticulturae,2012,134(1):222-226.

Screening on Fine Cordyceps militaris Strains

YU Hai-yang,WANG Yan-feng,SHI Lei,WANG Jin-he,PAN Chun-lei,SHENG Chun-ge,LIU Zi-tong,ZHANG Peng,DONG Xue-mei
(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang 157041,China)

In this experiment,mycelium growth rate,colony average diameter,mycelium dry weight of liquid fermentation,cultivate cycle,fruiting body morphology,weight and crude polysaccharide content of eight Cordyceps militaris strains were studied and compared,then a fine strain was screened.The test results showed that strain CC-8 which had a higher mycelium biomass and polysaccharides was the fine strain,it had the characteristic of orange and regular fruiting bodies,high fruiting incidence and yield,which was better than others.Purporting strain CC-8 was a fine species with high economic value,and CC-8 strain can be as a cultivated strain for industrial production.

Cordyceps militaris;mycelium;strain screening

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0017-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.004

中央引导地方科技发展专项项目（ZY16B08）；国家级星火计划重点项目（2015GA670002）。

于海洋（1986-），女，硕士，研究实习员，从事食（药）用菌遗传育种。E-mail:haiyang234@126.com

**通信作者：王延锋（1973-），男，博士，研究员，从事食（药）用菌遗传育种、栽培与菌渣综合利用研究。E-mail:mdjnks@126.com收稿日期：2017-07-16