TGF-β参与细胞内钙池操纵性Ca2+内流调节FGF23的释放

张冰冰 ，杨威 ，徐闯 ，夏成 ，张洪友 ，王春仁 ，，余丽芸

TGF-β参与细胞内钙池操纵性Ca2+内流调节FGF23的释放

张冰冰1，杨威2，徐闯2，夏成2，张洪友2，王春仁1，2，余丽芸1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

为了研究TGF-β是否通过细胞内钙池操纵性Ca2+内流来调节FGF23的释放，通过TGF-β处理大鼠骨肉瘤细胞利用荧光定量PCR技术检测细胞内FGF23和Orai1基因的表达。结果表明，与正常对照组细胞比较，TGF-β处理组FGF23与Orai1的基因表达水平显著升高，并且Orai1和NF-κB的抑制剂能够拮抗TGF-β的作用。表明TGF-β通过NF-κB/Orai1调节FGF23的释放，为进一步治疗慢性肾病等疾病提供依据。

TGF-β；成纤维生长因子23；细胞内钙池操纵性Ca2+内流

成纤维生长因子23（fibroblast growth factor，FGF23）主要在骨组织中表达，尤其在成骨细胞中大量分泌[1]。FGF23是调节机体钙磷代谢的核心激素之一[2]，也是调控 1，25（OH）2D3形成的重要调节子，FGF23可分别通过抑制肾 1 α羟化酶和上调Cyp24a1 来减少 1，25（OH）2D3的形成[3]，进而降低血液中 1，25（OH）2D3的含量[4-6]。 此外，FGF23 通过抑制肾小管对磷的重吸收，促进肾磷酸盐的排出[4]。FGF23 缺失导致血液中钙、磷和 1，25（OH）2D3的水平大幅升高，导致机体急速衰老，生命周期锐减，而上述现象很可能是由于血管钙化引起[3]。有文献报道NF-κB可激发UMR106细胞内的Ca2+活性进而调节FGF23的释放[7]。在UMR106细胞内Ca2+浓度的改变主要是由Ca2+池操纵性Ca2+内流（store-operated Ca2+entry，SOCE） 来实现的，而膜蛋白Orai1则是SOCE的主要调控蛋白[8]。近年来有文献报道TGF-β对成骨细胞的分化以及骨基质特性有重要作用[9]，而且TGF-β也是重要的NF-κB调节子[10]。因此，该实验利用UMR106细胞，探究TGF-β是否介导NF-κB激发Orai1信号通路来调控FGF23的释放。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

Trizol，反转录试剂盒，SYBG real-time PCR kit均购自Inventrogen公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养

大鼠骨肉瘤UMR106细胞培养在含10%FCS的高糖DMEM培养基中。UMR106细胞经1，25（OH）2D3（100 nM）预处理24 h促进FGF23的表达，之后分别添加终浓度20 ng·mL-1的TGF-β到含有或不含有Orai1抑制剂YM58483（100 nM）和NFκB的抑制剂Wogonin（100 μM）细胞培养基中继续处理24 h。

1.2.2 荧光定量RT-PCR

细胞总RNA的提取按Trizol试剂说明书进行操作，测定mRNA浓度，取1 μg总RNA按照反转录试剂盒说明合成cDNA，QRT-PCR运用SYBG染料法检测 FGF23，Orai1，NFκB65 的 mRNA 的表达水平[11]。根据GenBank中FGF23，Orai1，NFκB65和TBP mRNA序列，利用Primer5软件设计引物。QRT-PCR反应体系（20 μL）如下：SYBG10 μL，ddH2O 7 mL，上游引物（10 μM·L-1）、下游引物（10 μM·L-1）各 1 μL；cDNA模板1 μL。反应条件均为：95℃预变性3 min，95℃10 sec and 58℃30 sec，共计40个循环。

Rat Tbp（TATA box-binding protein）：

forward（5'-3'）：ACTCCTGCCACACCAGCC

reverse（5'-3'）：GGTCAAGTTTACAGCCAAGATTCA

Rat Fgf23

forward（5'-3'）：TGGCCATGTAGACGGAACAC

reverse（5'-3'）：GGCCCCTATTATCACTACGGAG

Rat Orai1

forward（5'-3'）：CGTCCACAACCTCAACTCC

reverse（5'-3'）：AACTGTCGGTCCGTCTTAT

Rat NFκB p65

forward（5'-3'）：TTCCCTGAAGTGGAGCTAGGA

reverse（5'-3'）：CAGTCGAGGAAGACACTGGA

1.2.3 统计学分析

采用Spass19.0统计学软件，分别运用t-test和ANOVA检测方法对NFκB p65和FGF23、Orai1的转录水平进行显著性分析，结果以means±SEM表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 TGF-β对NFκB p65转录水平的影响

如图1所示，与正常对照组相比，经20 ng·mL-1TGF-β刺激UMR106细胞的 NFκB p65的转录水平显著升高。

图1 TGF-β对NFκB p65转录水平的影响Fig.1 Effect of TGF-β on NFκB p65 transcript levels注：*，TGF-β处理组与正常对照组差异显著

2.2 TGF-β对Orai1转录水平的影响

如图2、图3所示，与正常对照组相比，在20ng·mL-1TGF-β刺激下，UMR106细胞Orai1的转录水平显著升高。分别添加Orai1抑制剂YM58483（图2）和NFκB 的抑制剂 Wogonin（图 3）后，TGF-β 刺激组的Orai1转录水平均显著降低。此外，分别添加的抑制剂YM58483和Wogonin与正常对照组相比，Orai1转录水平也显著降低。

图2 添加Orai1抑制剂YM58483，TGF-β对Orai1转录水平的影响Fig.2 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of YM58483注：*，TGF-β处理组与正常对照组差异显著#，添加YM 8483组与未添加组间差异显著

图3 添加NFκB抑制剂Wogonin，TGF-β对Orai1转录水平的影响Fig.3 Effect of TGF-β on Orai1 transcript levels in the absence or presence of wogonin注：*，正常对照组与TGF-β处理组差异显著#，添加Wogonin组与未添加组间差异显著

2.3 TGF-β对FGF23转录水平的影响

如图4、图5所示，与正常对照组相比，在20 ng·mL-1TGF-β刺激下UMR106细胞FGF23的转录水平显著升高，并且分别添加Orai1抑制剂YM58483（图4）和 NFκB的抑制剂 Wogonin（图 5）后，TGF-β 刺激组的FGF23的转录水平显著降低。

图4 添加Orai1抑制剂YM58483，TGF-β对FGF23转录水平的影响Fig.4 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of YM58483注：*，TGF-β处理组与正常对照组差异显著#，添加YM 8483组与未添加组间差异显著

图5 添加NFκB抑制剂Wogonin，TGF-β对FGF23转录水平的影响Fig.5 Effect of TGF-β on FGF23 transcript levels in the absence or presence of wogonin注：*，正常对照组与TGF-β处理组差异显著#，添加Wogonin组与未添加组间差异显著

3 讨论

FGF23是由骨组织中的成骨细胞分泌产生的内分泌因子，主要作用于肾组织，通过抑制肾1α羟化酶和尿磷重吸收等来调节1，25（OH）2D3的形成与活性，以及钙磷代谢等生理作用。在慢性肾病与心损伤疾病中，FGF23的水平显著升高，并且与这些病的预后不良有着直接关系[12-13]。因此，探究FGF23的生理病理机制对疾病的防治至关重要。

根据实验室前期研究，FGF23的释放是由SOCE引发的细胞内Ca2+浓度的升高来调节的。膜蛋白O－rai1组成了钙释放激活钙通道（CRAC）的离子通道，与其在内质网上的感受器STIM1相互作用，完成细胞钙池内钙离子的释放与进入，且Orai1在UMR106细胞内表达量相对较高，而转录因子 NFκB则是调节Orai1的主要信号，进而影响FGF23的释放[7]。已有文献报道，TGF-β可上调NFκB水平进而引发炎症反应[10，14]。实验利用荧光定量RT-PCR技术，首先验证了TGF-β上调UMR106细胞的NFκB水平，通过分别添加 Orai1抑制剂YM58483和NFκB的抑制剂Wogonin，分析TGF-β对Orai1和FGF23转录水平的影响，最终确证了TGF-β通过介导NFκB上调Orai1的转录水平进而调控FGF23释放这一新的信号通路。Orai1不仅是调控SOCE过程中Ca2+进入，而且具有调节细胞增殖迁移等作用，TGF-β作为NFκB的激活剂，可能通过NFκB激活Orai1信号通路启动成骨细胞的增殖，分化等促进FGF23的释放，从而在肾脏中发挥生理病理作用，随着血清中FGF23含量的显著升高加剧慢性肾病的病程发展，因此降低成骨细胞内钙离子的上述信号通路可调控FGF23的形成，为进一步治疗慢性肾病等疾病提供有利证据。

4 结论

TGF-β可通过NFκB依赖的上调细胞内Ca2+进入的调控膜蛋白Orai1调控FGF23在成骨细胞中的分泌，为进一步探究FGF23在慢性肾脏疾病中病理作用提供有力的研究基础。

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TGF-β-sensitive Store-operated Ca2+Entry in the Regulation of FGF23 Release

Zhang Bingbing1，Yang Wei2，Xu Chuang2，Xia Cheng2，Zhang Hongyou2，Wang Chunren1，2，Yu Liyun1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

To study whether the effect of TGF-β on FGF23 mRNA expression was involved and required Ca2+entry，FGF23 and Orai1 mRNA were measured by real-time RT-PCR in UMR106 cells.The results showed that FGF23 mRNA expression was significantly enhanced by TGF-β treat in UMR106；conversely，an effect was abolished by Orai1 inhibitor YM58483 and NF-κB inhibitor Wogonin.Moreover，Orai1 transcript levels were significantly up-regulated by TGF-β，an effect attenuated by wogonin.It indicated TGF-β up-regulates FGF23 was released by NF-κB dependent up-regulation of Orai1 transcription，which may give strategies for new therapeutic options.

TGF-β；FGF23；store-operated Ca2+entry

Q25

A

1002-2090（2017）05-0066-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.016

2017-03-06

国家自然科学基金青年项目（31502133）；黑龙江省科学基金面上项目（C2015043）。

张冰冰（1984-），女，讲师，德国图宾根大学毕业，现主要从事遗传与基因工程方面的教学与研究。

余丽芸，女，教授，博士研究生导师，E-mail：yuliyun1227@126.com。