L－肉碱对NAFLD脂肪肝大鼠肝脏线粒体能量代谢及抗氧化能力的影响

彭丽娜，赵艳薇，彭丽研

（1.廊坊师范学院运动人体科学教研室，河北廊坊065000；2.廊坊师范学院健美操教研室，河北廊坊 065000；3.北京北大方正软件技术学院，河北廊坊065000）

1 引 言

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是因饮食不当和结构不合理而引起的一种代谢性综合症，进一步发展为肝炎、肝硬化、肝癌等，严重危及患者生命。目前尚无特效药物可以全面抑制NAFLD的发生。L－肉碱（Carnitine），一种从红色肉类中提取，促使脂肪酸移向线粒体基质内而被氧化的关键物质，具有减脂，防衰老，改善脂肪肝，促进心脑血管等症效果显著［1－2］。研究表明，补充肉碱能促进肝脏中甘油三酯的分解，减轻肝脏负担［3］。本课题组前期研究成果表明，肉碱可以提高大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性，提高机体利用脂肪酸的速率［4］。根据现有对肉碱的研究成果，通过补充肉碱结合运动疗法，探讨肉碱对脂肪肝大鼠机体能量代谢的影响，了解NAFLD的作用机制，同时为医务工作者合理地利用训练手段结合营养补剂改善NAFLD的康复提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 材料

选取10月龄健康雄性wistar大鼠56只，体重在460±20 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。NADH，antimycin A，rotenone，cytochrome C等为 sigma公司产品；Dodecyl－β－D－maltoside（DB），2、6－Dichlorophenolindophenol（DCPIP）为Fluka产品；蔗糖、Tris－Hcl、EDTA等试剂均为国产；GSH－Px、SOD、MDA（南京建成）。XT20719型动物跑台（北京），YQ－3型电动匀浆机（江苏），KS50R台式高速高性能冷冻离心机（凯达），UV－1500紫外可见分光光度计（北京）。

2.2 方法

2.2.1 对象分组及造模 采用高脂饮食结合药物注射复制脂肪肝模型，每天投高脂饲料，吃完不添加，自由饮水。并按 10 mg／100 g［5］剂量腹腔注射氧四环素（每1ml针剂含药物20 mg），5天给药1次。模型制备期间分别于第4、6周后随机择其处死，取肝脏组织镜检观察成模情况，直至模型成功。淘汰模型不成功及死亡大鼠，保留48只模型大鼠参与试验。分4组：模型对照组（不运动，无肉碱，灌胃等量生理盐水），肉碱组（不运动，服肉碱），运训组（运动，无肉碱，灌胃等量生理盐水），肉碱＋运训组（运动且服肉碱）。

2.2.2 训练方案及肉碱的补充 根据有氧运动模型［6－7］，运训组和肉碱 ＋运训组两组动物进行6周递增负荷跑台训练；每周5天，每天1次，速度12、14、16、18、20、25m／min，时间是20、25、30、35、40、50 min。肉碱组大鼠每天 500 mg／kg［8］的肉碱灌胃，肉碱＋运训组大鼠按照训练计划，训练结束按剂量灌胃，最后一次运动至力竭，速度是 35 m／min［6］（除对照组），训练期间每周周末称体重一次。

2.2.3 肝脏线粒体的提取 力竭后腹腔注射2℅戊巴比妥钠麻醉，剖腹取肝，冰浴中剪碎，按体积比1∶5加入缓冲液匀浆，匀浆液在0～4℃下，离心（2000 rpm，15 min），弃沉淀，取上清；悬浮后再离心（2000 rpm，15 min），弃沉淀，取上清；两次离心所得上清液混合，离心（12000 rpm，15 min），弃上清，取沉淀；再次（12000 rpm，15min）离心，所得沉淀物即为大鼠肝脏线粒体［9］。

2.2.4 肝脏线粒体呼吸链酶活性及抗氧化指标的测定 将10μl线粒体蛋白加入到酶RCCI～IV反应缓冲液 2 ml中，3 min内连续测定 340、600、550 nm处NADH、FADH2、细胞色素C吸光值的变化表示肝脏线粒体呼吸链酶RCCI～IV的活性［10］。GSH－Px、SOD活性及MDA含量测定选自南京建成生物有限公司。在25℃室温下，测定肝脏线粒体呼吸链酶活性，考马斯亮蓝G250测定蛋白量。

2.2.5 数理统计 所有数据采用 SPSS19.0进行统计学处理，用（均数±标准差）表示。组间采用t检验，差异显著采用单因素方差分析，P＜0.05具有显著性差异，P＜0.01具有极显著差异。

3 结果

3.1 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性的影响

与对照组比较，肉碱组大鼠肝脏线粒体呼吸链RCCI、RCCIII、RCCIV活性提高无显著性差异（P＞0.05），RCCII活性提高出现显著性差异（P＜0.05）；与对照组比，运训组 RCCI、RCCIII活性提高出现显著性和非常显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），RCCII、RCCVI活性提高出现非显著性差异（P＞0.05）；与对照组比较，肉碱 ＋运训组 RCCI、RCCII、RCCIII活性提高出现显著差异和非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01），RCCIV活性提高无显著性差异。与肉碱组比较，肉碱＋运训组RCCI、RCCIII活性出现显著差异和非常显著差异（P＜0.05或 P＜0.01），RCCII、RCCIV活性提高无显著性差异（P＞0.05）。与运训组比，肉碱＋运训组RCCI活性提高出现显著差异（P＜0.05），RCCII、RCCIII、RCCIV活性提高无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

表1 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性的影响n＝12Table 1 Enzyme activities of liver m itochondrial respiratory chain with L－carnitine on fatty liver in rats（μmol／m in／mg.prot，±S，n＝12）

表1 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性的影响n＝12Table 1 Enzyme activities of liver m itochondrial respiratory chain with L－carnitine on fatty liver in rats（μmol／m in／mg.prot，±S，n＝12）

注：a与对照组比，P＜0.05，b与对照组比，P＜0.01；c与对照组比，P＜0.05，d与对照组比，P＜0.01。

.68分组 NADH－CoQ还原酶 FADH2－CoQ还原酶 CoQ－细胞色素C还原酶 细胞色素C±1.252 －－－ 122.936±20.425 －－－肉碱组 159.643±16.01814.99 －－－ 98.376±15.217a 27.68 －－－ 35.687±1.343 3.26 －－－ 137.981±11.11610.90 －－－运训组 180.852±17.239a 24.97 －－－ 86.195±13.20617.46 －－－ 68.617±1.639b 49.69 －－－ 118.667±15.2433.47 －－－肉碱＋运训 233.225±24.356bc 41.8131.5522.46103.438±16.642a 31.224.8916.6772.956±2.023bd 52.6851.085.95145.919±23.03515.755.4418氧化酶对照组 135.702±13.144 －－－ 71.142±12.174 －－－ 34.523

3.2 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体抗氧化能力的影响

与对照组比，肉碱组、肉碱＋运训组大鼠肝脏线粒体GSH－Px活性提高出现显著差异（P＜0.05）；运训组提高无显著差异（P＞0.05）；与对照组比，肉碱组、运训组、肉碱＋运训组SOD活性提高出现显著和非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01）；肉碱组、运训组、肉碱＋运训组大鼠肝脏线粒体MDA含量较对照组下降出现显著和非显著差异（P＞0.05或P＜0.05）。与肉碱组和运训组比，肉碱＋运训组GSH－Px、SOD活性提高、MDA含量下降出现显著性和非显著性差异（P＞0.05或P＜0.05）。见表2。

表2 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体抗氧化能力的影响Table 2 Effect of on fatty liver rat liver m itochondrial antioxidant capacity w ith L－carnitine（U per mg protein，±S，n＝12）

表2 L－肉碱对脂肪肝大鼠肝脏线粒体抗氧化能力的影响Table 2 Effect of on fatty liver rat liver m itochondrial antioxidant capacity w ith L－carnitine（U per mg protein，±S，n＝12）

注：a与对照组比，P＜0.05，b与对照组比，P＜0.01；c与对照组比，P＜0.05，d与对照组比，P＜0.01。

分组 GSH－Px活性 活性% SOD活性 活性% MDA含量 含量（%）53.24±8.25 －－－ 21.31±7.52 －－－ 15.25±.57 －－－肉碱组 74.57±11.65a 28.60 －－－ 33.88±8.13a 37.10 －－－ 12.53±3.15 17.84 －－－运训组 61.85±10.67 13.92 －－－ 42.90±10.17b 50.33 －－－ 11.81±2.19 22.56 －－－运动＋肉碱 86.24±15.65a 38.2713.5328.2855.13±14.90bc 61.3538.5522.18 9.94±1.23a对照组34.8220.6715.83

4 讨论

4.1 L－肉碱对NAFLD脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性的影响

NAFLD的形成与线粒体TCA的关键酶，线粒体呼吸链传递酶和丙酮酸脱氢酶等活性下降，氧化磷酸化功能受阻及游离脂肪酸进入线粒体释放能量受限等因素有关［11－12］。实验显示，力竭运动导致肝脏功能下降，严重损坏细胞呼吸功能［4］；而科学规律的有氧运动可改善大鼠心肌线粒体RCCI－RCCIV活性，降低 NAFLD患者血浆 SREBP－1c、RBP4、TNF－α水平，改善脂代谢紊乱，降低肝脏甘油三酯水平，有利于 NAFLD转归［13－14］。也有研究发现，肉碱可以降低脂肪肝患者血脂及肝脏中胆固醇含量，改善肝功能［15－16］。肉碱能够保护线粒体膜结构及电子传递链的完整性，提高大鼠肝脏线粒体电子传递链酶活性早已通过实验证明［4］。

本实验结果显示，补充肉碱、运动、补充肉碱结合运动均可提高脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸功能，出现肉碱＋运训组＞肉碱和运训组。显示，补充肉碱结合运动疗法在改善脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链功能效果更佳。其机制一方面是由于有氧运动促使大量游离脂肪酸进入肝脏线粒体进行β－氧化，减少肝脏脂肪堆积而产生的毒性作用，也不同程度的提高了线粒体电子传递链酶活性，提高线粒体ATP的合成能力［17］。另一方面，通过体外补充肉碱，加大肉碱的储备量，增加长链脂肪酸的跨膜转运能力，降低肝脏TG的合成，加速VLDL合成，改善胰岛素抵抗，抑制肝细胞色素P4502E1的活性表达，缓解肝脏内脂肪堆积和代谢紊乱，减轻由于细胞色素氧化酶缺失和能量代谢失调而造成的脂肪肝，促进肝细胞再生，提高肝脏功能［18］；总之，补充肉碱结合运动疗法可以通过提高线粒体呼吸链酶活性及能量代谢的速率来改善脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链功能，改善NAFLD症状。

4.2 L－肉碱对NAFLD脂肪肝大鼠肝脏线粒体抗氧化能力的影响

研究表明，有氧运动可以提高大鼠肝脏等线粒体GSH－Px、SOD活性，降低MDA含量；降低因高脂膳食而造成的脂质过氧化反应，清除氧自由基，减轻脂肪肝［19］。研究显示，运动结合肉碱在改善NAFLD患者的胆固醇代谢中比单纯补充肉碱效果更加明显［20］。本实验结果显示，适量的有氧运动、补充肉碱、运动结合补充肉碱均可以提高脂肪肝大鼠肝脏线粒体GSH－Px、SOD活性和降低MDA含量。其机制一方面是由于大强度力竭运动后肝脏中FFA增多，丧失线粒体跨膜电位，导致线粒体肿胀、破裂及坏死［21］；同时，大强度运动体内 ROS、MDA的过量生成，造成肝脏膜结构破坏，线粒体DNA改变，肝免疫力下降使肝出现纤维化，进一步加重NAFLD；而有氧运动可以降低肝内脂肪贮存，改善NAFLD症状［22］。另一方面，补充肉碱可以提高肝脏线粒体GSH－Px、SOD活性，减少肝脏受自由基的损伤，降低甘油三脂、总胆固醇、低密度脂蛋白和提高高密度脂蛋白的含量，促进肝细胞修复和再生，达到预防与防止NAFLD的不良反应［23］。

总之，补充肉碱结合运动可以提高脂肪肝大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性，提高机体的抗氧化能力和抵抗自由基的能力。但是，NAFLD的发生还与遗传、基因、年龄、环境、缺氧、吸烟、免疫、营养、药物、激素、铁超载、微量元素缺乏、体力活动不足及冠心病、高血压、高血脂、2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性综合征密切相关［24］，更应慎重综合多方面因素考虑，以达到最佳的康复疗法来减轻NAFLD患者的痛苦。