一种新兽用止泻中药复方制剂对大鼠的亚慢性毒性

姜玲玲　陈鸿宇　史开志

摘要：为申报一种新兽用止泻复方制剂，对其临床用药的安全性进行了检测，对该复方制剂进行了亚慢性毒性研究。采用80只Wistar大鼠随机分为4组，经口给药，剂量分别为3 000、1 500、750、0 mg/kg体质量，连续灌胃30 d。试验期间观察一般临床状况，每周测量大鼠体质量并据此调整染毒剂量。试验结束后测定试验动物血常规、血清生化指标，并进行病理解剖及病理组织学观察。结果表明，除高剂量组个别大鼠心、肺、睾丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）出现轻度瘀血外，其他各剂量组的实质器官未发现异常变化；血液学指标中除了高剂量组的嗜中性细胞绝对值水平显著升高（P<005）和单核细胞绝对值、单核细胞比率、红细胞压积水平显著下降（P<005）外，其余各组各项指标均在正常范围内，与对照组无显著差异。在本试验条件下，未发现该制剂对大鼠的生长发育产生影响，短期重复应用至少在1 500 mg/kg体质量饲喂条件下无亚慢性毒性。

关键词：兽用中药；多叶勾儿茶；复方制剂；大鼠；亚慢性毒性

中图分类号： S85374文献标志码：

文章編号：1002-1302（2017）16-0148-04

收稿日期：2016-04-07

基金项目：贵州省重大专项（编号：黔科合重大专项字[2013]6014）；贵州省农业类工程技术研究中心项目（编号：黔科合农G字[2015]4001）；贵州省科技厅、贵州省农业科学院联合基金（编号：黔科合LH字[2014]7701号）。

作者简介：姜玲玲（1987—），女，河南项城人，硕士，助理研究员，主要从事基础兽医学研究。E-mail：2056253464@qqcom。

通信作者：卜仕金，博士，教授，从事兽医药理与毒理学研究。E-mail：pushijin@aliyuncom。

动物腹泻是集约化生产条件下一种典型的多因素性疾病，各种动物均可发病，尤其见于仔猪、犊牛、羔羊等，给养殖业造成重大的经济损失。抗生素类药物的治疗不仅导致细菌耐药性越来越严重，而且其残留引起的畜产品质量安全问题给社会带来严重影响。中草药以无残留、不易产生耐药性、价格便宜等优点，在疾病防治和高质量的肉产品生产中发挥着重要的作用。

笔者所在课题组前辈根据中医辩证施治理论，结合当地特色中药——多叶勾儿茶[1-2]，对祖方改进后，研制出以多叶勾儿茶为主，以地榆、乌药等为辅的兽用止泻新复方制剂，在临床治疗仔猪腹泻、牛羊腹泻中取得理想疗效。结合前期工作，对该复方制剂毒理学进行研究，为该复方制剂的推广提供理论依据。

1材料与方法

11受试药物

止泻复方制剂由贵州省畜牧兽医研究所中兽医研究室提供，按制剂临床治疗比例稀释为1 mL含成品药03 g，换算为生药，1 mL含生药13 g，棕褐色液体，气味微苦。

12试验动物及试验条件

清洁级Wistar大鼠，由扬州大学比较医学实验动物中心提供，大鼠为4周龄、体质量80～120 g，合格证号：SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0004。试验动物饲养于扬州大学比较医学中心动物房内，室温为（24±2） ℃，人工白昼24 h。

13仪器

电子天平（感量01 g）、灌胃针、手术剪、手术刀等常规解剖器械；日立7150全自动生化分析仪；Sysmex KX-21血细胞分析仪；光学显微镜；LeicaVT1000S手动轮转切片机；HPX-9162MBE电热恒温培养箱；其他病理学检查常用仪器试剂等。

14方法

141染毒剂量及试验分组

80只大鼠随机分成对照组和受试物高、中、低剂量组，每组20只，雌雄各半（雌雄分开饲养，每笼饲养5只），组内动物个体体质量相差不超过平均体质量的10%，组间平均体质量相差不超过5%。结合急性毒性试验的结果，同时考虑亚慢性毒性试验的剂量设计原则，各组染毒剂量分别为3 000、1 500、750 mg/kg体质量，染毒时各组染毒体积控制在05～10 mL/100 g体质量范围内，对照组按 10 mL/100 g 体质量经口灌服洁净自来水。30 d染毒试验采用经口染毒，每天1次，连续经口灌服染毒30 d。试验期间每周定时称体质量，依据大鼠的体质量变化调整染毒剂量。

染毒期间每天观察试验鼠健康状况、采食及饮水变化。对出现异常的大鼠及时记录、分析大鼠的中毒症状表现及出现各症状的先后次序、时间。每周称体质量和饲料各1次，并计算平均摄食量、增质量及饲料转化率（耗料/增质量）。

142检测指标

最后一次染毒结束后扑杀所有大鼠，采用2%戊巴比妥钠溶液以4 mL/kg体质量腹腔注射麻醉后经腹主动脉采血进行血液学及血清生化指标检测。血液学指标包括白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞压积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板（PLT）等。血液生化检测包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLu）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、血清钾（K）、血清钠（Na）、血清氯（Cl）、血清钙（Ca）等。

143病理检查

1431大体剖检

试验结束时，对所有大鼠进行剖检，采用肉眼检查。做好记录，并将主要器官和组织用10%福尔马林溶液固定保存，以备进一步显微检查。

1432脏器称质量

在大体剖检的同时称取大鼠体质量及各主要脏器（包括心、肝、脾、肺、肾、胃、睾丸、卵巢和子宫）的质量并记录。计算各脏器的相对质量（脏器质量与体质量的比值），即脏器系数。

1433组织病理学检查

剖检时先对高剂量组及对照组中所有大鼠的主要脏器进行组织病理学检查。若发现高剂量组内大鼠脏器出现明显病变后，再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。其中心、肝、肺、肾、脾、胃、睾丸及卵巢和子宫的组织病理学检查为必测项目。

15数据处理

各处理组数据以x[TX-5]±s表示。用SPSS应用软件进行组间数据的显著性检验。采用t-检验比较试验组与对照组间增质量、脏器系数、血液生化等指标的显著性分析。

[BT1-5][STHZ]2结果

21临床表现

各组大鼠连续灌服染毒30 d期间，各处理组中大鼠临床表现正常。试验期间复方制剂对大鼠生长发育的影响结果见表1。统计学分析显示，各处理组中雌雄大鼠体质量变化无明显差异（P>005）。

注：同行数据各试验组与对照组分别进行t-检验（双尾检验），n=10，“”表示P<005，差异显著；“”表示P<001，差异极显著。下表同。

22血液学及血清生化指标

大鼠连续经口灌服染毒30 d后，各组血液学指标测定结果见表2。统计学分析显示，与对照组相比，复方制剂高剂量组嗜中性细胞绝对值水平明显升高（P<005）；单核细胞绝对值、单核细胞率、红细胞压积水平显著下降（P<005）。复方制剂中、低剂量组血液生化指标变化不显著（P>005）。

大鼠连续染毒30 d后，各组血清生化指标测定结果见表3。统计学分析显示，与对照组相比，复方制剂高剂量组天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶水平显著升高（P<005）。

23脏器系数

大鼠连续经口灌服染毒30 d后，各组脏器系数指标测定结果见表4。统计学分析显示，与对照组相比，复方制剂高剂量组雌鼠的肝、肾的脏器系数水平明显升高（P<005）。

24病理学变化

对经口连续灌服染毒30 d后宰杀的大鼠剖检后，对照组中所有大鼠经肉眼观察均未发现任何异常和可疑病变，对照组所有大鼠的心、肝、腎、脾、肺、胃、睾丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）及子宫（♀）等组织进行的组织病理学切片检查，均未发现任何异常和可疑病变，表明30 d染毒试验饲养条件控制符合要求。高剂量组中所有大鼠经肉眼观察亦均未发现任何异常和可疑病变，对高剂量组所有大鼠的心、肝、肾、脾、肺、胃、睾丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）及子宫（♀）等组织进行组织病理学切片检查，除高剂量组个别大鼠心（图1、图2）、肺（图3、图4）、睾丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）（图5、图6）出现轻度瘀血外，各剂量组中的大鼠肝、肾、心、脾和肺等组织亦均未发现异常的组织病理学变化。

3讨论与分析

本中药复方制剂是由获得国家发明专利技术成果“一种兽用止泻中药制剂及其制备方法”进行熟化与转化而得，主要针对动物腹泻下痢，临床疗效稳定，本研究参照《中药、天然药物长期毒性指导原则》[4]，连续给药1个月，旨在观察Wistar大鼠长期灌胃该制剂提取液后可能出现的毒性反应、毒性效应关系，找出无毒反应剂量，为临床使用剂量和主要观察指标等提供参考依据。

亚慢性毒性试验是指在试验动物部分生存期内，每天反复接触受试物后在一定时期内所引起的不良反应。本试验通过观察灌胃药物后大鼠的临床表现、血液学、生化指标及组织切片等几个方面试验来考察复方制剂的毒性。各组大鼠连续灌服染毒30 d期间，各组大鼠临床表现正常，与空白对照组比较复方制剂各剂量组大鼠体质量无明显变化，说明对大鼠的正常生长无影响。

血液学及血清生化指标是毒理学试验中经常用于测评的指标，通过衡量机体血液成分在受试药物作用下有无改变，从而[CM（25]确定受试药物的毒性大小[8]。本试验血液学指标结果显示，复方制剂中、低剂量组与对照组均无显著差异；高剂量嗜中性细胞绝对值水平显著升高（P<005）；单核细胞绝对值、单核细胞率、红细胞压积水平显著下降（P<005）；但缺乏剂量相关性，临床意义不大。血清生化指标中、低剂量组与对照组均无显著性差异，高剂量组天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）水平显著升高（P<005）。AST、ALT、LDH是用来评价肝损伤的重要血清酶指标[9-11]，血清酶检查的基本原理在于肝损害时酶由细胞内大量释放入血，导致血清中的含量升高[12]。齐云等报道SPF级11周龄Wistar雄性大鼠AST值为（1517±133） U/L，雌性大鼠为（1966±245） U/L；詹纯列等也报道普通级Wistar大鼠AST为（315±134） U/L，SPF级大鼠为（324±238） U/L[14]。本试验高剂量组AST指标（14450±1856） U/L虽然高于对照组，但组织学观察无明显异常，且数值在正常范围值以内。LDH常作为心肌异常诊断的参数，结合组织病理学切片检查发现高剂量组中1/5大鼠心脏出现轻度瘀血，而LDH偏高可能与其心脏组织轻度瘀血有关，表明复方制剂高剂量可能对大鼠的心脏有影响。

脏器系数和病理学检测显示，中、低剂量组与对照组均未发现任何异常和可疑病变，高剂量组雌鼠的肝、肾的脏器系数

显著高于对照组（P<005），但这2个组织的组织病理学检查未见明显异常，表明连续给药30 d对上述组织尚无实质性的影响，这可能与给药时间较短，且药物对脏器功能的影响往往先于形态学的影响有关，更长时间给药是否会导致肝脏和肾脏的形态学改变还有待进一步研究。组织病理学切片检查中，除高剂量组个别大鼠心、肺、睾丸出现轻度瘀血外，各剂量组中的大鼠肝、肾、心、脾和肺等组织亦均未发现异常的组织病理学变化。

4小结

亚慢性毒性试验显示，中、低剂量组大鼠血液学及血清生化指标和脏器组织与对照组无显著性差异，综合分析，该制剂中剂量组对大鼠的生长发育未产生影响，短期重复应用至少在1 500 mg/kg饲喂条件下无亚慢性毒性。

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