复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表达的影响

2017-10-25王立新王元松苏阳田风胜崔荣岗

中国医药导报 2017年26期

王立新++王元松　苏阳　田风胜++崔荣岗

[摘要] 目的探討复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表达的影响。方法采用随机数字表法将60只大鼠分为正常组（10只）、造模组（50只）。成模后，将40只糖尿病大鼠随机分为糖尿病组和复荣通脉低、中、高剂量组，每组各10只。复荣通脉低、中、高剂量组分别给予复荣通脉胶囊0.7、1.4、2.8 g/kg灌胃，正常组和糖尿病组给予等量纯净水灌胃。8周后，留取大鼠心肌制备病理切片，观察各组血糖、血脂及Smad7蛋白的阳性表达。结果治疗前、治疗8周后，糖尿病组和复荣通脉低、中、高剂量组血糖水平均明显高于正常组（P < 0.05），各组大鼠组内治疗前后血糖差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗8周后，糖尿病组和复荣通脉低、中、高剂量组总胆固醇、三酰甘油水平均明显高于正常组（P < 0.05）。正常组Smad7蛋白表达呈强阳性，糖尿病组和复荣通脉低、中、高剂量组Smad7蛋白表达均明显下降（P < 0.05﹚；与糖尿病组、复荣通脉低剂量组比较，复荣通脉中、高剂量组Smad7蛋白高表达（P < 0.05﹚。结论复荣通脉胶囊具有上调糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表达、抑制糖尿病心肌细胞损伤的作用。

[关键词] 复荣通脉胶囊；糖尿病；心肌；Smad7蛋白

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（b）-0017-04

Effect of Furong Tongmai Capsules on Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus

WANG Lixin WANG Yuansong SU Yang▲ TIAN Fengsheng CUI Ronggang

Department of Endocrinology， Clinical Medical College of Integrated Chinese and Western Medicine in Cangzhou Affiliated to Hebei Medical University， Hebei Province， Cangzhou 061001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Furong Tongmai Capsules on Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus. Methods Sixty rats were randomly divided into normal group （10 rats） and model group （50 rats） by random number table method. After the model was made， 40 rats with diabetes mellitus were randomly divided into diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules， with 10 rats in each group. Low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were given 0.7， 1.4， 2.8 g/kg of Furong Tongmai Capsules by gavage， normal group and diabetes mellitus group were given equal quantity of purified water. After 8 weeks， the myocardium in rats was preserved to make pathological section. The positive expression of blood glucose， blood lipid， Smad7 protein in each group was observed. Results Before treatment and after treatment for 8 weeks， the levels of blood glucose in diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were all higher than those of normal group （P < 0.05）， while there were no significant differences of blood glucose within each group before and after treatment （P > 0.05）. After treatment for 8 weeks， the levels of total cholesterol， triacylglycerol in diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were all higher than those of normal group （P < 0.05）. The Smad7 of normal group showed high positive expression， which of diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules was all decreased （P < 0.05）； compared with diabetes mellitus group and low dose group of Furong Tongmai Capsules， the Smad7 expression of medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules was increased significantly （P < 0.05）. Conclusion Furong Tongmai Capsules have the function of increasing the Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus， inhibiting myocardial cell injury.endprint

[Key words] Furong Tongmai Capsules； Diabetes mellitus； Myocardium； Smad7

糖尿病心肌病是由于高血糖导致的心肌损害，其病理特点为广泛灶性心肌坏死，可导致心力衰竭、心源性休克及严重心律失常，危及生命。目前临床常用的治疗方法是在降糖的基础上改善微循环和心肌细胞代谢。我们在临床观察中发现，复荣通脉胶囊对糖尿病合并心肌病有可靠疗效，同时我们通过动物实验发现，复荣通脉胶囊可以降低大鼠血清ADMA水平及NF-κB表达，增强内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达[1]。在另外一组实验中，复荣通脉胶囊可降低大鼠血清内皮素1（ET-1），升高NO，抑制纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1），促进组织型纤溶酶原激活物（t-PA）在大鼠胸主动脉的表达，改善血管内皮功能紊乱，调节纤溶系统，对糖尿病大血管病变有治疗作用[2]，但其作用机制尚未完全阐明。现将复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表达影响的研究报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用2月龄雄性Wistar大鼠60只，体重200～250 g，SPF级，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：1405034，单位许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 药物

复荣通脉胶囊药物组成：水蛭、地龙、全蝎、黄芪、当归、玄参、葛根、首乌藤、川牛膝、穿山龙、甘草。由河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院中药制剂科提供，每粒0.5 g，含生药2 g。冀药制字：Z20070041。

1.3 试剂及仪器

链脲佐菌素（美国Sigma公司，批号S0130-1G）；柠檬酸钠（北京索莱宝科技有限公司，批号S8220）；Smad7免疫组化试剂盒（淼森科技有限公司）；电子血糖仪（德国罗氏罗康全活力型）；全自动生化分析仪（日本日立7600-010）；光学显微镜（日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11）；离心机（德国Eppendorf-5430）；石蜡切片机（德国莱卡RM2015）；DSHZ-300型恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及模型的建立造模前12 h禁食，自由饮水。将60只大鼠按照随机数字表法进行分组，造模组（50只）、正常组（10只）。按文献[3-4]的方法造模：将1%链脲佐菌素（STZ）溶于0.1 mmol/L、pH=4.2的无菌柠檬酸缓冲液，腹腔注射60 mg/kg，正常组大鼠注射相同剂量的柠檬酸缓冲液。注射3 d后测大鼠随机血糖，由尾静脉取血，血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功44只。

1.4.2 分组与给药成模后采用随机数字表法将40只糖尿病大鼠分为糖尿病组、复荣通脉低剂量组、复荣通脉中剂量组、复荣通脉高剂量组，每组各10只。正常组和糖尿病组每日给予纯净水10 mL/kg灌胃，复荣通脉低、中、高剂量组首先换算出大鼠的药物治疗等效剂量（通过人体-大鼠体表面积比值表）[5]，分别给予0.7、1.4、2.8 g/kg灌胃，糖尿病组和正常组用相同容量纯净水灌胃，灌胃容量10 mL/kg，每日1次，连续8周。饲养条件：自由进食水，普通饲料，每天重新配制灌胃药物，室温控制在23～26℃，日光灯照明，明暗各12 h，4笼1只。治疗过程中糖尿病组和复荣通脉中、高剂量组各有1只大鼠死亡。

1.4.3 标本的处理治疗8周后，各实验组大鼠制备标本前1 d隔夜禁食12 h，自由饮水。麻醉方式采用3%戊巴比妥（80 mg/kg）腹腔内注射。测尾静脉血糖，解剖大鼠，通过腹主动脉采血，室温放置1 h后离心10 min，测总胆固醇（TC）及三酰甘油（TG）等生化指标。

1.4.4 石蜡切片与免疫组化测定用4%多聚甲醛固定大鼠心肌细胞，经过脱蜡水化、透明、封片制备切片。切片厚度5 mm，经免疫组化染色后，应用计算机彩色病理图文分析系统，分析阳性表达细胞占整个视窗的百分比。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，组内比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后血糖变化比较

治疗前，糖尿病组与复荣通脉低、中、高剂量组血糖比较，差异无统计学意义（P > 0.05），但均较正常组明显升高（P < 0.05）。治疗8周后，糖尿病组与复荣通脉低、中、高剂量组血糖比较，差异亦无统计学意义（P > 0.05），但与正常组相比，以上各组血糖仍明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。各組大鼠组内治疗前后血糖差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠心肌Smad7蛋白表达比较

与正常组比较，糖尿病组及复荣通脉低、中、高剂量组Smad7的表达均明显降低（P < 0.05﹚；与糖尿病组、复荣通脉低剂量组比较，复荣通脉中、高剂量组Smad7蛋白表达明显升高（P < 0.05﹚；复荣通脉中剂量组与高剂量组Smad7蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。正常组可见Smad7（棕黄色颗粒样）呈高表达，糖尿病组、复荣通脉低剂量组可见Smad7（棕黄色颗粒样）呈低表达，复荣通脉中、高剂量组可见Smad7（棕黄色颗粒样）呈中等表达。见图1（封三）。

3 讨论

我国2型糖尿病患病率为9.7%，成人糖尿病总数为9240万[6]，糖尿病合并心脑血管疾病常见。长期高血糖导致糖脂代谢紊乱，氧化应激增加，出现线粒体肿胀、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等细胞的改变[7]。氧化应激和炎症在糖尿病性心肌病的发生中有重要作用[8]。炎症是糖尿病血管病变的独立危险因素，其水平高低直接影响血管病变的发生和发展[9]。心肌细胞Smad7的改变贯穿于多种心脏病理生理过程中，并可能在冠心病、心脏肥厚和心力衰竭等疾病中起到关键作用[10]。endprint

糖尿病大鼠心肌细胞中Smad7的蛋白表达水平显著降低，Smad7抑制受体激活型SMAD信号转导对于心脏可能是一种保护作用[11]。通过安体舒通治疗，大鼠心肌组织中Smad7的蛋白表达高于对照组，可以有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能[12]。灯盏花素也可以通过升高Smad7的蛋白，改善糖尿病大鼠的心功能[13]。通过黄芪注射液和苓桂术甘汤干预心肌再灌注损伤的大鼠，可以增加心肌Smad7的表达，减少心肌细胞的凋亡[14-15]。

复荣通脉胶囊中水蛭为君，地龙、全蝎为臣，全方结合其他益气养阴中药，在既往实验及临床研究中，我们观察到其具有抗凝血、抗炎、改善微循环等药理作用[16-18]，其抗炎治疗可以改善细胞的氧化应激，抑制炎症因子，保护糖尿病大鼠的血管[19]。君药水蛭可以上调大鼠心肌细胞Smad7蛋白的表达，抑制糖尿病大鼠心肌的病理改变[20]。

本研究通过模拟糖尿病大鼠高血糖导致心肌细胞受损，发现糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表达明显下降，其参与介导了糖尿病大鼠的心肌损伤。用复荣通脉胶囊进行干预后，中、高剂量组能够明显上调Smad7的表达，通过抑制Smad7信号传导通路，减少心肌细胞的凋亡，两组实验结果并无明显差异，但低剂量组并无此种效果。

复荣通脉胶囊对大鼠心肌有保护作用，且具有剂量依赖效应，但并非严格的线性关系，给予中等剂量治疗最符合成本-效益比。

[参考文献]

[1] 边云.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠胸主动脉eNOS、ADMA及NF-κB表达影响的实验研究[D].石家庄：河北医科大学，2015.

[2] 崔荣岗.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠血清ET-1、NO水平及胸主动脉PAI-1、t-PA表达影响的实验研究[D].石家庄：河北医科大学，2015.

[3] 张均.现代药理实验方法学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：981.

[4] 于德民，吴锐，尹潍，等.实验性链脲佐菌素动物模型的研究[J].中国糖尿病杂志，1995，3（2）：105-109.

[5] 徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法[M].北京：人民卫生出版社，2005：202-204.

[6] 《中国糖尿病防治指南》编写组.中国糖尿病防治指南[M].北京：北京大學医学出版社，2014.

[7] Hou J，Zheng D，Zhong G et al. Mangiferin mitigates diabetic cardiomyopathy in streptozotocin-diabetic rats [J]. Can J Physiol Pharmacol，2013，91（9）：759-763.

[8] 韩佳，李卫平，栾家杰，等.黄芪总苷对实验性糖尿病小鼠心肌保护作用的研究[J].安徽医科大学学报，2012，47（3）：290-294.

[9] 唐振媚，林芳，黄群英，等.2型糖尿病高血糖与炎症两者联合对血管病变的影响[J].中国医药导报，2014，11（3）：50-53.

[10] Euler-Taimor G，Heger J. The complex pattern of SMAD signaling in the cardiovascular system [J]. Cardiovasc Res，2006，69（1）：15-25.

[11] 孟庆芸，符丽娟，张博.N-乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用[J].中国动脉硬化杂志，2012，20（2）：125-129.

[12] 罗经宏，李玲.安体舒通对心衰大鼠心肌组织TGF-β/Smads信号通路相关分子表达的影响[J].山东医药，2014， 54（2）：23-25.

[13] 杨颖婷，王晓梅.灯盏花素对糖尿病大鼠心肌转化生长因子-β1和Smad7表达的影响[J].广东医学，2011，32（20）：2629-2632.

[14] 马速佳，周志强，李祥波，等.黄芪注射液对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中Smad3、Smad7表达的影响[J].重庆医学，2014，43（13）：1597-1599.

[15] 龚明玉，杜超，许倩，等.苓桂术甘汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（23）：273-276.

[16] 李倩，李宝芬.复荣通脉胶囊主要药效学研究[J].中国中医药杂志，2007，22（5）：316-318.

[17] 吕树泉，张淑芳，王猛，等.复荣通脉胶囊治疗糖尿病周围血管病变的临床研究[J].中医药导报，2016，22（23）：99-101.

[18] 王立新，王元松，田风胜，等.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠坐骨神经Bax及Bcl-2表达的影响[J].中国医药导报，2016，13（12）：24-27.

[19] 田风胜，王佟，王霞，等.三黄片对糖尿病大鼠胸主动脉细胞间黏附分子-1及血管细胞间黏附分子-1表达的影响[J].中国医药导报，2015，12（35）：16-19.