芹菜素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

高爱梅+程晓莉

[摘要] 目的 探討芹菜素（APG）对裸鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用及其相关机制。 方法 建立人肝癌阿霉素（ADM）耐药细胞BEL-7402/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，24只移植成功的裸鼠随机分为三组：对照组（ADM 3 mg/kg）、APG组（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg）和miR-101 mimics组（miR-101 mimics 5 mg/kg+ADM 3 mg/kg），每组8只。上述药物每3天注射l次，共7次。给药结束后处死裸鼠，切取移植瘤组织。免疫组化法检测Ki-67蛋白表达评价肿瘤细胞增殖，免疫蛋白印迹法检测肿瘤组织核转录因子红细胞系相关因子-2（Nrf2）蛋白的表达，qRT-PCR法测定移植瘤组织miR-101水平。 结果 与对照组相比，APG和miR-101 mimics能显著抑制肿瘤生长（P < 0.05），抑制肿瘤细胞增殖（P < 0.05或P < 0.01），此外，APG和miR-101 mimics还能下调肿瘤组织Nrf2蛋白的表达（P < 0.01），上调miR-101表达（P < 0.05）。 结论 APG能有效抑制肝癌移植瘤生长，其机制可能与抑制肿瘤细胞增殖，上调miR-101表达和下调Nrf2表达有关。

[关键词] 芹菜素；肝癌；化疗增敏；核转录因子红细胞系相关因子-2；miR-101

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（b）-0009-04

Inhibiting effect of apigenin on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice

GAO Aimei1 CHENG Xiaoli2

1.Department of Pharmacy， the Fifth People′s Hospital of Shanghai， Fudan University， Shanghai 200240， China； 2.Department of Pharmacy， Shenzhen Bao′an District Maternity and Child Health Care Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518133， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of apigenin （APG） on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice and the possible molecular mechanism. Methods Models of nude mice were transplanted with BEL-7402/doxorubicin （ADM）， and randomly divided into 3 groups， each group had 8 mice. The groups of mice were treated i.p. as follow： ADM （3 mg/kg， control group）， APG+ADM （50 mg/kg+3 mg/kg， APG group）， miR-101 mimics +ADM （5 mg/kg+3 mg/kg， miR-101 mimics group）， every three days for a total of seven times. The volumes of tumor were measured. After the end of medication， the mice were sacrificed for measurement of tumor weights. Tumor cell proliferation was analyzed by Ki-67 immunostaining. Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 （Nrf2） protein level was measured by Western blot. miR-101 level was detected by Real-time PCR. Results The volumes and weights of tumors in APG group and miR-101 mimics group were decreased compared with the control group （P < 0.05）. Compared to the control group， APG and miR-101 mimics resulted in inhibition of tumor cell proliferation （P < 0.05 or P < 0.01）， inhibition of Nrf2 expression （P < 0.01）， and up-regulation of miR-101 levels （P < 0.05）. Conclusion APG can inhibit the growth of hepatocellar carcinoma， its mechanism may partly be to inhibit the expression of Ki-67 and Nrf2， up-regulate the level of miR-101.

[Key words] Apigenin； Hepatocellular carcinoma； Chemosensitization； Nrf2； miR-101endprint

芹菜素（4'，5，7-trihydroxyflavone，apigenin，APG）是天然存在的一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中。研究发现，芹菜素具有抗氧化、抗诱变、抗炎症、抗肿瘤等多种药理活性[1-4]。多项研究表明芹菜素对肿瘤具有抑制作用，其主要作用机制包括抗肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭、转移以及抗氧化等[5-8]。因此，芹菜素作为一种天然高效低毒的抗肿瘤药已成为目前肿瘤治疗研究的热点之一[9-10]。笔者前期实验发现，APG可逆转人肝癌阿霉素（doxorubicin，ADM）耐药细胞BEL-7402/ADM的耐药，增强ADM化疗敏感性，增加細胞内ADM的蓄积[11]。APG这种协同抑癌作用可能与下调耐药细胞核转录因子红细胞系相关因子-2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）信号通路有关。为了进一步研究APG在体内的抗肿瘤活性，本研究构建裸鼠肝癌皮下移植肿瘤动物模型，探讨APG的体内抗肿瘤活性及相关机制，以期为肝癌耐药的治疗提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

APG，陕西慧科植物开发有限公司；RPMI-1640，美国GIBCO公司；小牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，美国Amresco公司；ADM，浙江海正药业股份有限公司；鼠抗人Ki-67单克隆抗体、即用型二步法（非生物素）免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人Nrf2抗体，美国Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，美国Jackson免疫研究实验室；TRIzol，美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR试剂盒，TaKaRa公司；定量PCR仪，美国ABI公司。

1.2 细胞和动物

BEL-7402/ADM人肝癌耐药细胞购自南京凯基生物科技公司，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于5%CO2、37℃细胞培养箱内传代培养。BALB/c-nu雌性裸小鼠，体重为22～24 g，鼠龄4～5周，购于北京华阜康生物公司，动物合格证号：SCXK（京）2014-0004。按规定饲养于实验动物中心的SPF屏障系统内。

1.3 裸鼠肝癌模型的建立及分组给药

取对数生长期的BEL-7402/ADM细胞，经胰酶消化，离心洗涤2次后，用生理盐水调整至浓度为3×107/mL。取细胞悬液0.3 mL，用1 mL注射器将细胞接种到裸鼠右腋下皮下组织，10 d左右可触及米粒大小结节。挑选出体积为50 mm3左右的裸鼠24只进行分组：对照组（ADM 3 mg/kg腹腔注射）、APG组（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg腹腔注射）和miR-101 mimics组（miR-101 mimics 5 mg/kg瘤内注射+ADM 3 mg/kg）腹腔注射，每组8只。上述药物每3天腹腔注射l次，共7次。给药后每3天测移植瘤体积。移植瘤体积按公式V=ab2/2（a=瘤长，b=瘤宽）计算[12-14]，并绘制生长曲线。末次给药后第2天，颈部脱臼法处死荷瘤鼠，剥离瘤体，观察大体形态并称取瘤重。

1.4 免疫组化检测

瘤组织经4%多聚甲醛固定后包埋脱水，制成5 mm厚的切片。切片常规脱蜡，加入3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS漂洗3次；用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波修复5 min，PBS漂洗3次；加入正常兔血清37℃孵育15 min，以封闭非特异性抗原；加一抗Ki-67多克隆抗体（1∶200），37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加相应的二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；DAB显色，苏木精复染核，逐级脱水，透明，封片。染色结果的判定标准：细胞核可见棕黄色颗粒，即Ki-67染色阳性表达。每张切片随机选取5个高倍视野，计数阳性染色细胞数，计算平均增殖指数。增殖指数=（阳性染色细胞数/肿瘤细胞总数）×100%。

1.5 Western blot检测

取适量瘤组织，搅碎成匀浆，裂解获得蛋白。根据BCA试剂盒说明对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，SDS凝胶电泳，转膜，一抗孵育，4℃过夜，二抗室温孵育1 h，于凝胶成像系统中曝光。用Image J软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.6 qRT-PCR检测

TRIzol提取组织总RNA，按试剂盒说明将总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，以U6为内参。miR-101上游引物：5′-CGGCGGTACAGTA CTGTGATAA-3′，下游引物5′-CTGGTGTCGTGGAGTC？鄄GGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCA？鄄CA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTG？鄄CGT-3′。反应条件：95℃ 15 min，95℃ 15 s，55℃ 20 s，70℃ 30 s，30个循环反应。实验结果应用2-ΔΔCt方法进行相对定量分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠一般情况和肿瘤生长状况

接种10 d左右，裸鼠皮下可见粟粒大小的类圆形结节，质硬，不可活动。在接种后的前20 d，肿瘤增长缓慢，裸鼠精神良好，反应敏捷，饮食、大小便及活动正常，移植瘤未见破溃；在接种后的第21～30天，肿瘤增长速度开始加快，裸鼠精神状态较之前变得萎靡不振、活动减少、反应迟钝、消瘦等；从第30天以后，肿瘤增长速度更加迅速，裸鼠变得愈加萎靡不振，基本上不活动，饮食和饮水量急剧减少，身体愈加消瘦。整个实验过程中无裸鼠意外死亡。endprint

2.2 抗肿瘤作用

待移植模型成功建立后（接种后第21天）确定分组并开始给药。治疗开始后每3天测量一次移植瘤体积，并绘制生长曲线。结果显示，对照组肿瘤生长最快。与对照组相比，APG、miR-101 mimics组移植瘤生长受到明显抑制。用药结束后处死裸鼠，剥离瘤体，观察其大体形态可见：肿瘤呈结节状，包膜完整，血供丰富，切面呈灰白色，无周围组织浸润及出血坏死灶。移植瘤称重结果显示，与对照组相比，APG、miR-101 mimics组瘤重均呈不同程度的抑制，差异有统计学意义（P < 0.05）；APG组与miR-101 mimics组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.3 肝癌移植瘤组织Ki-67的表达

Ki-67是反映细胞增殖活性的细胞核抗原。结果显示，Ki-67抗原表达于移植瘤细胞核内，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色，其中对照组肿瘤组织可见大量片状棕黄色阳性表达，而其余各治疗组细胞阳性表达较对照组少。结果表明，与对照组相比，APG与miR-101 mimics均可抑制移植瘤细胞增殖，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）；APG组与miR-101 mimics组比较，Ki-67的表达明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封三）。

2.4 Western blot检测移植瘤组织Nrf2蛋白表达

Western blot测定移植瘤组织Nrf2蛋白的表达水平。结果显示，在APG及miR-101 mimics组Nrf2蛋白的表达明显低于对照组（P < 0.01），提示APG与miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能與下调Nrf2蛋白有关。APG组与miR-101 mimics组比较，Nrf2蛋白的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.5 qRT-PCR检测移植瘤组织miR-101的表达

结果显示，在APG及miR-101 mimics组，miR-101的表达明显高于对照组（P < 0.05），提示APG及miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能与上调miR-101有关。APG组与miR-101 mimics组比较，miR-101的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

化疗是肝癌综合治疗的重要手段之一。ADM是常用的肝癌化疗药，属细胞周期非特异性药物，具有强烈细胞毒性，可抑制肿瘤细胞RNA和DNA合成[15]，但其副作用也非常明显，主要表现为多器官毒性，包括肝毒性、心脏毒性和骨髓抑制等，且长期应用还容易降低机体敏感性，导致化疗失败[16]。因此，在肝癌化疗过程中降低化疗药毒副作用，增强其敏感性，提高化疗效果己成为目前亟待解决的难题。

前期实验发现，APG在体外可明显增加BEL-7402/ADM对抗肿瘤药的敏感性，其机制与下调PI3K/Akt/Nrf2信号通路有关。本实验构建了BEL-7402/ADM裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，进一步研究了APG在体内对肝癌细胞的作用。结果显示，APG组和miR-101 mimics组肿瘤生长均较对照组明显减慢；比较各组抑瘤率结果显示，APG组和miR-101 mimics组瘤重均呈不同程度的抑制。Ki-67是与细胞增殖相关的核抗原，它是存在于增生细胞核的一种非组蛋白核蛋白，故可用于识别生长中的正常细胞和肿瘤细胞，评价细胞增生情况[17-20]。免疫组化结果显示，APG组与miR-101 mimics组的增殖指数明显低于对照组；上述体内实验结果表明，APG与miR-101 mimics可能通过抑制肿瘤细胞增殖，从而起到增强ADM抗癌效果的作用；进一步Western blot检测瘤组织Nrf2蛋白的表达，结果显示，APG与miR-101 mimics能够降低移植瘤Nrf2蛋白的表达；qRT-PCR法测定瘤组织的miR-101水平，结果显示，在APG及miR-101 mimics组，miR-101的表达明显高于对照组。提示APG增加BEL-7402/ADM对ADM的敏感性可能与miR-101和Nrf2有关。

综上所述，本研究结果显示APG可能通过上调肿瘤组织miR-101表达、下调肿瘤组织Nrf2表达，抑制肿瘤细胞增殖，进而有效提高肝癌细胞对ADM的化疗敏感性，促进其抗癌疗效。

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（收稿日期：2017-06-12 本文編辑：程 铭）endprint