转染HBx诱导肝癌细胞株Bel—7404多药耐药的初步研究

林松挺　陈正义　钟文洲

[摘要] 目的 研究HBx轉染对肝癌细胞株Bel-7404增殖、细胞周期以及多药耐药的影响，并探讨HBx转染诱导肝癌多药耐药发生的可能机制。 方法 选用人肝癌Bel-7404细胞株进行转染，根据HBx转染情况将细胞分为三组，分别为转染HBx细胞组（Bel-7404-HBx组）、转染空载体细胞组（Bel-7404-con组）和空白细胞组（Bel-7404组）；实时定量PCR检测各组细胞中HBx RNA的表达。Western blot法检测各组细胞中HBx、Notch-1和多药耐药蛋白（MRP）的表达，CCK-8法检测各组细胞增殖活性和多药耐性，流式分析仪检测各组细胞生长周期。 结果 PCR扩增凝胶电泳显示Bel-7404-HBx组有HBx片段出现，而其他两组未见HBx mRNA的表达；Western bolt结果显示在Bel-7404-HBx组处有蛋白条带（即HBx蛋白），而Bel-7404组和Bel-7404-con组未见表达。与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，Bel-7404-HBx组细胞增殖显著加快（P < 0.05）；与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，Notch-1和MRP在Bel-7404-HBx组的蛋白表达增加；细胞周期结果显示，与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，Bel-7404-HBx组G0/G1期细胞显著减少（P < 0.05），S期显著增加（P < 0.01），G2/M期变化不大（P > 0.05）；多药耐药实验显示，与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，丝裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂和奥沙利铂在Bel-7404-HBx组中耐药指数明显增加（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 转染HBx的Bel-7404细胞可能通过诱导Notch-1与MRP的过表达，最终导致肝癌细胞株Bel-7404增殖能力增强和多药耐药的发生。

[关键词] HBx；肝癌细胞株；Bel-7404；Notch信号通路；多药耐药蛋白；多药耐药

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0016-05

[Abstract] Objective To study the effects of HBx transfection on proliferation， cell cycle， and multidrug resistance of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404， and to investigate the possible mechanism of HBx transfection in inducing the multidrug resistance of liver cancer. Methods Human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 was transfected， and the cells were divided into three groups according to the transfection conditions， which were transfected HBx cell group （Bel-7404-HBx group）， transfected cell group with empty vector （Bel-7404-con group） and blank cells group （Bel-7404 group）. The expression of HBx RNA in all groups was detected by real-time PCR. The expression of HBx， Notch-1 and multi-drug resistance protein （MRP） in all groups was detected by Western blot， the cell proliferation activity and multidrug resistance in all groups were determined by CCK-8， and the cell growth cycle was analyzed by flow cytometer. Results PCR amplified gel electrophoresis showed that HBx fragments were detected in Bel-7404-HBx group， while no HBx mRNA expression could be found in the other two groups； Western blot indicated that the protein band （HBx protein） was detected in the Bel-7404-HBx group， while no expression was found in Bel-7404 group and Bel-7404-con group. Furthermore， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the cell proliferation in Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05）； compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the protein expression of Notch-1 and MRP in Bel-7404-HBx group was increased significantly； the results of cell cycle showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the number of cells in G0/G1 phase was decreased significantly （P < 0.05）， which was significantly increased in S phase （P < 0.01）， while there was no significant differences in G2/M phase （P > 0.05）； multidrug resistance experiments showed that， compared with Bel-7404 group and Bel-7404-con group， the resistance index of Mitomycin， Adriamycin， 5-Fluorouracil， Cisplatin and Oxaliplatin in the Bel-7404-HBx group was increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Bel-7404 cells transfected by HBx may induce overexpression of Notch-1 and MRP， leading to the increase of multiplication capacity of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404 and the occurrence of multidrug resistance.endprint

[Key words] HBx； Hepatocellular carcinoma cell line； Bel-7404； Notch signaling pathway； Multi-drug resistance protein； Multidrug resistance

传统意义上的化疗对肝癌的治疗虽然取得了一定的疗效，但是具有较大的毒副作用，其潜在引起了肿瘤细胞的耐药性，并引发肿瘤细胞的扩散与转移[1]。多药耐药是影响化疗疗效以及导致患者死亡的主要原因[2]。肝癌对化疗药物相对不敏感，对其如何发生多药耐药的机制仍不清楚，因此寻找多药耐药的原因尤为关键。HBx由HBV基因组编码，具有多种调控功能，能激活多个与肿瘤侵袭相关的原癌基因及转录因子，是肝细胞癌发病的独立危险因素[3-5]。Notch信号通路是一个重要的高度保守的细胞间信号转导通路，其作用广泛。最近的研究表明，Notch信号通路不仅对胚胎期肾脏的发育起至关重要的作用，而且参与多种肿瘤疾病的发生和发展[6]，Notch通路能够通过血管内皮生长因子（VEGF）促进肿瘤血管的发生，从而参与促进肿瘤细胞的生长[7]，多药耐药蛋白（MRP）的过表达是肝癌产生多药耐药（MDR）的重要机制[8-9]。本研究采用基因转染的方法将HBx基因转入肝癌Bel-7404细胞中，观察HBx对Bel-7404细胞中Notch信号通路和MRP表达的影响，并探讨转染对肝癌细胞增殖和多药耐药的影响及其可能的作用机制，为Bel-7404的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌Bel-7404细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库，本所传代保存，置于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清RPMI-1640培养基（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）的恒温培养箱内培养。

1.2 试剂

DMEM高糖细胞培养液（美国Gibco公司，批号：12100046）；DMEMF12（美国Gibco公司，批号：12400 024）；HBSS缓冲液（上海研卉生物技术有限公司，批号：BS0101）；FcR阻断剂、寡核苷酸引物根据HBx基因的序列自行设计引物，由长沙赢润生物公司合成；Trizol裂解液（美国赛默飞世尔科技，批号：15596026）；Taqman MicroRNA反转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技，批号：4366596）；Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国赛默飞世尔科技，批号：722255）；Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海前尘生物科技有限公司，批号：40302ES20），B27补充剂（美国GIBCO，批号：17504-044）；CCK-8试剂盒（上海钰博，批号：YB1198）；小牛血清（北京索萊宝公司，批号：01-045）；胰蛋白酶（北京瑞达恒辉科技发展有限公司，批号：HB-0103-01）；RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司，批号：11875-093）。

1.3 方法

1.3.1 重组X质粒转染肝癌Bel-7404细胞 Bel-7404细胞生长于含10%胎牛血清的DMEN中，以脂质体转染的方法分别将重组x质粒、未重组x质粒转染入Bel-7404细胞中，命名为转染HBx细胞组（Bel-7404-HBx组）、转染空载体细胞组（Bel-7404-con组）和空白细胞组（Bel-7404组），具体步骤如下：选取对数生长期Bel-7404细胞，胰酶消化接种于直径25 cm培养瓶，细胞数为1×106/L，6 h后细胞即可贴壁，继而进行转染。37℃预热的无血清培养基加入DNA 5 μg、Trans Fast Reagent 15 μL，立即涡旋混匀，室温下静置10～15 min。小心移出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体/DNA混合物，轻轻加入培养瓶中，37℃孵育24 h，轻轻加入含血清的培养基（完全培养基）4 mL，不必移去脂质体/DNA混合物，37℃继续孵育48 h。

1.3.2 实时定量PCR检测HBx mRNA的表达 TRIzol试剂提取并收集处于对数生长期的三组肝癌Bel-7404细胞的HBx mRNA，RNA的完整性利用1%的琼脂糖变性凝胶电泳进行检测，RNA的纯度和浓度利用紫外可见分光光度计检测；在70℃（10 min）、冰育（2 min）、42℃（60 min）、70℃（10 min）反应条件下，利用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA；在95℃（5 s）、60℃（20 s）、72℃（5 s）的反应条件下进行qRT-PCR反应，40个循环，进行3次重复试验。

1.3.3 Western blot法检测肝癌Bel-7404细胞中HBx、Notch-1和MRP的表达 转染组和未转染组进行细胞总蛋白的提取，通过Bradford的方法调整相同的蛋白浓度后，进行电泳获得根据分子量分离的蛋白条带，根据Pierce公司Western blot显像试剂盒的指导说明来进行，蛋白的NC膜电转，进行蛋白封闭和一抗结合，一抗结合后洗脱，再进行二抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗体。ECL试剂盒显色后，暗室发光拍照，以β-actin为内参进行系统软件分析。

1.3.4 CCK8法检测细胞增殖活性 取三组细胞以1×106/L接种于96孔板中，每孔100 μL，培养48 h后每孔加入10 μL CCK8试剂，4 h后在450 nm波长下检测各孔OD值，重复3次取均值。以OD值为纵坐标、时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞周期 收集转染48 h后的三组细胞，用冷PBS洗涤细胞后加入体积分数70%冷乙醇固定过夜。用流式细胞仪进行检测，采用Cell Quet软件分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.3.6 各组细胞耐药性检测 将三组处于对数生长的Bel-7404细胞制成浓度为1×106/L的细胞悬液，每孔100 μL，接种于96孔板，每孔设3个复孔。孵育24 h后，换用浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L丝裂霉素、阿霉素培养液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、顺铂、奥沙利铂培养液。孵育48 h后，去除含药液，每孔加100 μL不含药培养基和10 μL CCK-8，设空白孔。孵育2 h后，酶标仪测吸光度值，设a为加药组的吸光度，b为不加药细胞组的吸光度，c为无细胞的空白组的吸光度，药物对细胞的抑制率（%）=1-[（a-c）/（b-c）]×100%。计算5种药物抑制率为50%的浓度（IC50）和耐药指数（RI），RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。endprint

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBx mRNA的表达

将PCR扩增产物进行凝胶电泳，可见Bel-7404-HBx组有目的片段出现，而其他两组未见HBx mRNA的表达。见图1。

2.2 HBx蛋白的表达

Western bolt结果显示，在Bel-7404-HBx组处有蛋白条带（即HBx蛋白），而Bel-7404组和Bel-7404-con组未见表达。Notch-1和MRP在三组中的表达不同，在Bel-7404-HBx组的蛋白条带最大，Bel-7404-con组次之，Bel-7404组最小。见图2。

2.3 转染HBx后各组细胞的生长曲线

与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，Bel-7404-HBx组细胞增殖显著加快（P < 0.05或P < 0.01）。见图3。

2.4 转染HBx后细胞周期变化

与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，Bel-7404-HBx组G0/G1期细胞显著减少（P < 0.05），S期显著增加（P < 0.01），G2/M期变化不大（P > 0.05）。见表1。

2.5 耐药性比较

与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较，5种药物在Bel-7404-HBx组中耐药指数增加明显（P < 0.05或P < 0.01），意味着Bel-7404-HBx组耐药性增强，对且多种化疗药物产生耐药。见表2。

3 讨论

HBV慢性感染是世界范围内原发性肝细胞癌的主要发病原因之一[10]，HBx基因致肝细胞癌发生的机制是目前研究的热点。HBx基因存在于HBV基因的第4个阅读框，具有强大的生物学功能，包括转录反式激活病毒基因组和宿主细胞基因、增强转录因子DNA结合特性、抑制p53蛋白活性、参与细胞信号传导途径和细胞凋亡的调节等。这些功能可能与肝细胞癌的发生具有密切的关系[11]。研究发现肝癌细胞组织中HBx呈弥漫性表达。一些体内及体外研究也发现HBx可诱导细胞的恶性转化甚至参与癌变发生[12-13]。因此，观察HBx对体外细胞增殖的影响，可为进一步研究HBx致肝细胞癌的发生机制提供依据和线索。

Notch信号在肿瘤的发生和演进过程中有重要作用，紊乱的Notch信号不仅能够直接引起肿瘤的发生，而且可通过与其他多条信号通路的交互作用，以间接的方式最终诱导肿瘤的形成[14]，在很多组织肿瘤的发生过程中均出现了Notch信号通路的异常，Notch信号的激活可通过促进细胞增殖和抑肝癌细胞凋亡活化的Notch-1，通过增强CDK2和CycIinD的活性而促进细胞周期的进程[15]。本研究中利用qPCR检测结果显示，转染的Bel-7404细胞内HBx的RNA和蛋白表达明显，这意味着转染Bel-7404细胞后构建过表达HBx的肝癌细胞成功。本研究还发现，转染HBx的人肝癌Bel-7404细胞中的Notch-1蛋白表达明显高于Bel-7404组和Bel-7404-con组，提示Bel-7404细胞中HBx的过表达诱导了细胞内Notch-1表达水平的增加，造成细胞内Notch信号通路的紊亂。同时细胞增殖和周期检测结果显示，转染HBx后细胞增殖能力显著提高，细胞生长周期S期增加，提示Notch-1的活化诱导了Bel-7404细胞增殖的发生。

肿瘤细胞的多药耐药是导致肿瘤细胞治疗失败和疾病复发的主要原因之一[16]。有报道指出，检测患者体内MRP的表达可以作为监测恶性肿瘤细胞原发性耐药的主要指标[17-18]。肿瘤细胞产生MRP与药物外排泵ABC转运蛋白的过度表达与细胞凋亡水平异常改变、DNA修复活性增强、细胞内酶异常改变和器官微环境改变有密切关系[19]，此外Notch-1信号与肿瘤细胞多药耐药的形成有重要的联系，过表达的Notch-1能够增加与多药耐药相关的ABBCC1基因的表达，诱导多药耐药现象的形成[20]。本研究发现，转染HBx的Bel-7404细胞多药耐药明显增强，这意味着转染HBx的Bel-7404细胞可能通过诱导Notch-1和MRP的过表达，最终导致多药耐药的发生。此外，在此研究基础上检测Notch通路的活化情况及由此引起凋亡抑制蛋白livin的表达，同时研究livin的表达后多药耐药相关蛋白表达的变化，并观察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及多药耐药蛋白表达之间的相关性是下一步的研究重点，为乙肝相关性肝细胞癌开展新的临床治疗提供新靶点。

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（收稿日期：2017-06-13 本文编辑：张瑜杰）endprint