新型HIV逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂的虚拟筛选

肖泽云　李凯　李爱秀

[摘要] 目的 构建3-OH HEPT类针对HIV逆转录酶非核苷类抑制剂作用靶点和整合酶的双靶点抑制剂[RT（NNRTI）/IN]药效团模型，对中药化学数据库（TCMD）进行搜索，寻找潜在的新型HIV双靶点抑制剂。 方法 从已知的3-OH HEPT类HIVRT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂出发，构建药效团模型，基于药效团模型和Lipinski五规则对TCMD进行筛选，发现新的抗HIV双靶点抑制剂。 结果 构建的药效团模型包括6个药效特征基团，以符合6个药效特征基团中任意5个为条件，在测试集数据库中验证性搜索命中全部16个化合物，检出率达到了100%。利用所建的六点药效团模型和Lipinski五规则对TCMD筛选，得到符合条件的化合物229个，其中包含已知的抗HIV活性化合物。 结论 建立的药效团模型和筛选策略为后续研究打下了较好的基础。

[关键词] 3-OH HEPT衍生物；RT（NNRTI）/IN；双靶点抑制剂；药效团模型；虚拟筛选

[中图分类号] R918 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To create the pharmacophore of 3-OH HEPT derivatives of dual inhibitors against HIV non-nucleoside reverse transcriptase inhibit or binding pocket and integrase [RT（NNRTI）/IN]， filter traditional Chinese medicine database （TCMD） with the pharmacophore， and find novel dual inhibitors of HIV. Methods Based on the known 3-OH HEPT derivatives against HIV RT（NNRTI）/IN， the pharmacophore was created. TCMD was filtered with the pharmacophore and Lipinski's five rules. Results The pharmacophore of six features was created. 16 molecules which matched five out of the six features were hit by searching from texting database， and the detection rate was 100%. 229 compounds were hit when used the pharmacophore of six features and Lipinski's five rules to filter TCMD， which contained compounds that were known inhibitors of HIV. Conclusion The pharmacophore and the screening strategy lay a good foundation for further studies.

[Key words] 3-OH HEPT derivatives； RT（NNRTI）/IN； Dual inhibitors； Pharmacophore； Virtual screening

艾滋病（AIDS）是由人體免疫缺陷病毒（HIV）引起的获得性免疫缺陷综合征，其治疗一直是全世界关注的焦点。目前，AIDS尚没有根本治愈的方法，是与癌症并列的全球十大医学难题之一，临床上主要采用高效抗逆转录疗法（highly active anti-retrovirus therapy，HAART）治疗AIDS，属于多组分多靶点药物组合疗法。然而，HAART多药联合容易引起HIV病毒的交叉耐药[1]，治疗方案的复杂性，严重的药物毒副作用以及高昂的治疗费用影响了患者的依从性。针对HAART的治疗现状，单组分多靶点抗HIV药物成为研发热点。

目前，HIV单组分多靶点药物仍处在先导化合物的发现和活性测试阶段，尚未有化合物进入临床研究[2-3]。通过合理药物设计和筛选途径得到的HIV单组分多靶点抑制剂包括异靶标多靶点抑制剂[4-12]和针对同靶标不同活性部位的多靶点抑制剂[13-14]，其中以作用于非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）作用位点和整合酶（integrase，IN）链转移抑制剂（strand transfer inhibitor of integrase，INSTI）活性位点的双靶点抑制剂[简写为“RT（NNRTI）/IN”][4-9]居多，主要包含3-OH HEPT衍生物[4-5]、TNK-651和二酮酸（DKA）融合型[6-7]、TNK-651和GS-9137融合型[8]以及地拉韦啶（DLV）和DKA融合型[9]等。

Tang等[4-5]基于合理药物设计理念，合成了一系列3-OH HEPT类衍生物，抗HIV实验发现其中一部分化合物对HIV逆转录酶（RT）和IN均有抑制活性。虽然尚未有3-OH HEPT类化合物进入抗HIV临床研究，但已证明该类化合物母核3-羟基嘧啶-2，4-二酮是具有潜力的抗HIV双靶点抑制剂母核。本研究以已知的3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂为研究对象，运用构象搜索、构象叠合和药效团识别技术[15-16]，构建3-OH HEPT类RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂药效团模型，并结合Lipinski五规则对中药化学数据库（TCMD）进行筛选，从中寻找潜在的新型HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 TCMD

TCMD[17]是由中科院过程工程研究所分子设计课题组研发的科学数据库产品，本研究所用版本为TCMD2003.1，包括9127个化合物结构及其相关信息。

1.1.2 分子模拟与分子设计软件包（MOE）

MOE[18]由加拿大Chemical Computer Group公司開发，本研究使用的版本为MOE2009.10。

1.2 方法

1.2.1 构建数据库

对文献报道的化学合成的3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂进行收集、整理，通过MOE数据库构建模块构建数据库。

1.2.2 构建药效团模型

1.2.2.1 构象搜索 在MOE构象搜索模块对化合物1～5进行构象搜索，得到其最低能量构象。参数设置如下：搜索策略选择LowModeMD；构象能量截断值（cutoff）设定为7 kcal/mol，即能量大于E-min+cutoff（E-min是全局极小值）的构象将被删除；RMS梯度（Gradient）为0.005；RMSD限定值为0.25？魡；其他参数保留默认设置。

1.2.2.2 识别药效特征基团 在MOE分子叠合模块，将抑制剂分子1～5最低能量构象进行叠合，保留最佳叠合构象。然后利用MOE药效团分析模块研究化合物1～5共有的药效特征基团。设置如下参数：化合物的构象分析方式为As-Is；化合物均为活性分子；药效特征基团半径小于等于1.4？魡；生成药效特征基团个数最多为6个，此外，药效特征基团活性分子覆盖率为90%；其他参数保留默认值。

1.2.2.3 构建药效团模型 在MOE药效团构建模块完成，具体步骤如下：①在MOE药效团构建模块导入最佳叠合构象，根据“1.2.2.2”中得到的共有药效特征基团，在Unified Info模块设定药效特征基团组合方式；②运用药效团Consensus模块分析最佳叠合构象，设定药效特征基团半径以及相互之间的空间距离限制，构建药效团模型；③以构建的药效团模型为提问结构，对测试集数据库进行验证性搜索，调整药效特征基团半径和药效特征基团组合模式，使命中化合物达到最多。

1.2.3 数据库搜索

以构建的药效团模型为提问结构，运用MOE数据库搜索模块，对TCMD进行筛选，然后再根据Lipinski五规则[19]，滤掉不符合条件的化合物。

2 结果

2.1 数据库构建

对文献报道的3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂进行总结，构建测试集数据库3-OHHEPTMDB，包括16个化合物（表1）。从中选择刚性较强、活性较高的化合物1～5构建药效团模型。

2.2 药效特征基团计算结果

根据药效特征基团计算结果，结合文献中3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂与RT和IN分子模拟结果[4-5]，得到化合物1～5共有的药效特征基团包括疏水中心或芳环中心两个，二价金属离子螯合中心两个，金属离子螯合中心或氢键给体一个，芳环中心一个。药效特征基团与最佳叠合构象见图1。

2.3 药效团模型

本研究构建了3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂六点药效团模型（图2），其中包含INSTI药效特征基团二价金属离子螯合中心F1、F3，半径均为0.7？魡；NNRTI和INSTI共有的药效特征基团金属离子螯合中心或氢键给体F2，半径为0.7？魡；芳环中心F4，半径为1.5？魡；疏水中心或芳环中心F5和F6，半径均为1.5？魡。以所建六点药效团模型为提问结构，对3-OHHEPTMDB进行验证性搜索，命中6个化合物，检出率为37.5%；以符合6个药效特征基团中任意5个为条件，命中全部16个化合物，检出率达到了100%。

2.4 数据库搜索

基于所建六点药效团模型对TCMD进行筛选，命中445个化合物。根据Lipinski五规则，滤掉不符合条件的化合物，得到229个化合物，其中黄酮类化合物居多，与药效团模型匹配较好的黄酮类化合物蛇葡萄素（Ampeloptin）结构式及其空间构象与药效团模型叠合见图3。

3 讨论

本研究以已知的3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂为出发点，构建了3-OH HEPT类HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂六点药效团模型，既包括分别属于NNRTI和INSTI的药效特征基团，又含有INSTI与NNRTI共有的药效特征基团，综合运用药效团模型和Lipinski五规则对TCMD进行筛选，得到符合条件的化合物229个。

在构建药效团模型的过程中，本研究定义C-6位苄基为疏水中心或芳环中心F5，而Tang等[4-5]通过分子模拟研究发现C-6位苄基基团作用于NNIBP氨基酸残基Y188，在分子水平验证了药效特征基团F5选择的合理性。此外，Tang等[4-5]对HEPT类进行分子对接研究发现N-1位的苄基基团结合点位于DNA与IN结合的疏水口袋，而本研究构建的药效团模型定义N-1位的苄基基团为芳环中心或疏水中心F6。分子对接的实验结果表明，N-3羟基不仅能够与RT NNIBP的氨基酸残基Lys101之间形成氢键相互作用，而且能够螯合IN活性口袋中的二价金属离子Mg2+，N-3羟基为NNRTI和INSTI共有的药效特征基团，定义N-3羟基为氢键受体或金属离子螯合中心F2。此外，根据药效特征基团分析结果，分别定义嘧啶环2，4位羰基为金属离子螯合中心F1和F3。以构建的六点药效团模型为提问结构，对3-OHHEPT.mdb进行验证性搜索，符合6个药效特征基团中任意5个的检出率达到了100%，验证了所建药效团模型的合理性。endprint

虛拟筛选得到化合物以黄酮类化合物居多，已有实验研究表明蛇葡萄素能够减少HIV p24抗原的表达，并干扰HIV与靶细胞的融合，进而抑制HIV的感染[20]，本研究预测其也有可能通过作用于RT和IN来发挥抗HIV作用。目前，已有部分黄酮类化合物被证实是HIV RT和IN双靶点抑制剂，如黄芩苷、黄芩素、槲皮素等，黄酮类化合物是具有较大潜力的HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂。但由于药效团筛选是基于配体结构的筛选，没有考虑化合物与酶的相互契合，会得到假阳性结果。本研究筛选出的化合物将有待进一步通过分子对接、ADME/T等筛选，并通过实验验证，从而发现新型HIV RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂先导化合物。

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（收稿日期：2017-06-24 本文編辑：程 铭）endprint