张家口坝上地区人群环氧合酶-2基因多态性与胃癌发病的相关性

邹建平，张建军，马晓雁，王志恒，李林臣，刘素芳

(1.张家口市第一医院急诊科，河北 张家口 075000；张家口市第一医院检验科，河北 张家口 075000；2.张家口市万全中医院外科，河北 张家口 076250)

张家口坝上地区人群环氧合酶-2基因多态性与胃癌发病的相关性

邹建平1，张建军1，马晓雁1，王志恒1，李林臣2，刘素芳3

(1.张家口市第一医院急诊科，河北 张家口 075000；张家口市第一医院检验科，河北 张家口 075000；2.张家口市万全中医院外科，河北 张家口 076250)

目的 分析张家口坝上地区人群环氧合酶-2(COX-2)基因多态性与胃癌发病的关系。方法 选取2015年6月至2017年1月于张家口坝上地区居住10年以上的居民200例为研究对象，其中健康者100例作为对照组，胃癌患者100例作为胃癌组，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对两组进行基因分型，然后经非条件性Logistic回归分析COX-2基因单核苷酸多态性(SNP)rs3218625与胃癌发病风险的关系。结果 对照组和胃癌组的年龄＜65岁者比例分别为55.0%及58.0%，男性比例分别为70.0%及74.0%；连续或偶尔吸烟者比例为47.0%及54.0%，差异均无统计学意义(P＞0.05)；对照组和胃癌组COX-2 SNP rs3218625基因型为GG的比例分别为93.0%及89.0%；基因型为GA的比例分别为5.0%及10.0%；基因型为AA的比例分别为2.0%及1.0%，基因型为(AG+AA)的比例分别为7.0%及11.0%；经非条件性Logistic回归分析发现，COX-2基因SNP rs3218625与胃癌的发生密切相关，且基因型GA出现频率越高，胃癌发生风险越高(OR=2.463，P=0.021)。结论 张家口坝上地区人群COX-2基因多态性可能会增加胃癌的发生风险，其中SNP rs3218625位点GA出现频率是胃癌发生的危险因素之一。

环氧合酶-2；单核苷酸多态性；胃癌；聚合酶链式反应

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率居全世界范围内所有恶性肿瘤的第4位。早期预防是避免胃癌发生的关键，通过了解胃癌在分子水平上的发病机制，可判定易感人群，进而为制定胃癌个体化防治的可行性对策提供一定的理论支持[1-3]。在导致胃癌的代谢酶基因中，环氧合酶-2(COX-2)的作用最为突出，已经成为当前胃癌研究领域的热点，人类基因组中存在大量单核苷酸多态性(SNP)，其是不同个体间疾病易感性、敏感性、表型等的遗传基础[4-5]。目前基于SNP的相关研究，已成为多基因复杂性状疾病遗传学分析的最为常用及有效的方法。以往研究表明，COX-2基因的启动子区某些SNP可使其表达上调，使其携带者易患食管癌、胃癌和其他相关的消化系统癌症疾病或其他人类癌症，并与肿瘤细胞的增生、分化、浸润、转移密切相关[6-7]。张家口坝上地区地处高原，其气候与生活习惯与其他地区相比具有一定的特殊性及差异性，本地胃癌患病率居高不下。本研究旨在从分子水平上揭示张家口坝上地区人群中调控生成COX-2的SNP与胃癌发病的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年6月至2017年1月于张家口坝上地区居住10年以上的居民200例为研究对象。其中100例经胃镜检查及病变部位活检确诊的胃癌患者作为胃癌组，排除继发病例与复发病例；既往有消化性溃疡性疾病者；伴有其他恶性肿瘤或严重性疾病者。另100例健康者作为对照组，对照组健康者要求无癌症家族史和慢性胃病史等。

1.2 方法

1.2.1 外周血提取基因组DNA 分别采集胃癌组与对照组血样2 mL，经抗凝处理，离心取细胞沉淀，加入人红细胞裂解液300 mL，3 min后离心30 s沉淀白细胞，加入35µL蛋白酶K，于50℃作用3 h，然后采用氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测COX-2基因SNP rs3218625G/A多态性 PCR扩增引物序列：primer1：5'-CTATGGGCAGAGAGAAGGAG-3'；primer2：5'-AGCTTGCATGACCAGAACCC-3'；PCR反应体系均为50 µL：MgCl23.0µL，dNTPs 4.0µL，上下游引物各4.0µL，DNA聚合酶10 U，模板50 ng，10×Buffer 5.0µL，双蒸馏水补至50 µL。扩增条件：95℃，5 min；94℃，30 s，52.4℃，30 s，72℃，30 s，共 40 个循环，72℃，7 min。PCR产物以Taq限制性内切酶酶切，酶切体系：PCR产物10µL，酶10 U，10×Buffer Tango 3.0µL，双蒸馏水补至30µL，水浴37℃过夜。30 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，另选取10%样本进行重复检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差(s)表示，组间比较采用t检验；COX-2基因SNP rs3218625与胃癌发病的关系采用Logistic回归分析，并用优势比和95%可信区间表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的一般资料比较 两组受检者的年龄、性别、吸烟史及萎缩性胃炎家族史等方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组受检者的一般资料比较[例(%)]

2.2 COX-2 SNP rs3218625基因PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 采用限制性内切酶MSPⅠ对各个基因型COX-2 SNP rs3218625基因PCR产物进行验证，酶切产物为200 bp与182 bp的为GG基因型。酶切产物为382 bp、182 bp、200 bp的为GA型，酶切产物只有200 bp的为AA型，见图1。

2.3 两组受检者COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其与胃癌的关系 COX-2 SNP rs3218625有3种基因型分别为GG、GA、AA，其在对照组与胃癌组中的频率分别为93.0%，5.0%，2.0%及89.0%，10.0%，1.0%，两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡规律。经Logistic回归分析发现，COX-2基因SNP rs3218625与胃癌的发生相关，其中GA基因型携带者胃癌发病风险明显升高(P＜0.05)，见表2。

图1 SNPrs3218625PCR产物酶切后电泳图(胃癌组)

表2 两组COX-2 SNP rs3218625基因型的分布及其与胃癌的关系

3 讨论

河北地区胃癌患病率46.29/10万，胃癌的发生与遗传、饮食和环境有关，且其中具有胃癌家族史人群的患病率是正常健康人群的3倍。目前有关张家口地区人群胃癌发生相关危险因素方面的研究还未见报道。COX-2基因是肿瘤患者靶向治疗的候选基因之一，其过度表达与肿瘤细胞的过度增殖、侵袭及转移等生物学行为密切相关，COX-2基因参与肿瘤的发生、发展过程[8-9]。另外，张子房等[10]研究发现，胃癌组织中COX-2基因的阳性表达率显著高于癌旁组织；国外研究也证实，胃癌发病至转移期间COX-2基因均呈高表达状态，COX-2基因异常高表达与胃癌进展过程中肿瘤细胞的增殖、转化、侵袭及转移均密切相关[11]。国外研究报道，COX-2基因与胃癌发生、发展具有重要关联，是相关研究的候选基因，且目前靶向COX-2治疗恶性肿瘤[12]，如食管癌、结肠癌等消化道肿瘤的研究已深入开展，并已取得一定的成效，COX-2基因有望成为预防、治疗恶性肿瘤的基因靶点，成为今后肿瘤防治的研究方向。

本研究在进一步从遗传水平上研究胃癌患者COX-2高表达的原因。COX-2基因表达可刺激血管生成因子表达增多，促进淋巴管、微血管生成，为肿瘤细胞的生长提供必需营养物质，同时也为肿瘤细胞进入循环系统提供了重要通道；COX-2基因表达还可增强基质金属蛋白酶活性，提高肿瘤细胞与外基质蛋白的黏附能力，利于浸润、转移及侵袭等恶性生物学行为的发生，进而促进胃癌等恶性肿瘤的进展；COX-2还可使肿瘤血管生成、胃黏膜厚度增加和疏松化、降低机体对肿瘤细胞的局部免疫[13]。COX-2基因的启动子区某些SNP可使基因表达上调，增加肿瘤发生的风险。胃黏膜损伤、胃溃疡、胃癌或癌前损伤患者病变组织中COX-2 mRNA及COX-2蛋白表达量显著升高，对胃癌的发生中具有一定的作用[14]。COX-2基因包含10个外显子及9个内含子，SNP rs3218625位于第10外显子，其G＞A改变导致氨基酸Gly转变为Arg，使该位点酶活性明显增加[15]。此外，已有研究报道，COX-2基因SNP rs3218625 G＞A这一多态性与中国人群食道癌的发生密切相关，其中AG基因型可明显增加食道癌发病的风险[16]。因此本研究以COX-2基因的SNP rs3218625 G＞A为研究位点，并与本地域人群一般资料相结合，从分子遗传水平分析胃癌患者COX-2高表达的原因。本研究结果显示，COX-2 SNP rs3218625有3种基因型分别为GG、GA、AA，其在对照组及胃癌组中的频率分别为93.0%、5.0%、2.0%及89.0%、10.0%、1.0%，两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡规律，经Logistic回归分析发现，COX-2基因SNP rs3218625与胃癌的发生相关，其中GA基因型携带者胃癌发病风险明显升高，与相关研究[17]结果相似，可能是由于SNP rs3218625 G＞A的改变导致了Arg的产生，使得酶活性增高，由于COX-2基因编码区SNP不同，导致不同个体对环境中致癌物的敏感性不同，AG基因型可增大酶活，增强机体对对环境中致癌物的敏感性，因而促进了肿瘤的发生和发展。

综上所述，张家口坝上地区人群COX-2基因SNP rs3218625与胃癌发生密切相关，其中SNP rs3218625基因型GA是胃癌发生的危险因素之一。

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Correlation of COX-2 genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.

ZOU Jian-ping1,ZHANG Jian-jun1,MA Xiao-yan1,WANG Zhi-heng1,LI Lin-chen2,LIU Su-fang3.1.Emergency Department,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA;3.Wanquan Hospital of TCM,Wanquan 076250,Hebei,CHINA

Objective To explore the correlation of cyclooxygenase-2(COX-2)genetic polymorphisms with incidence of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou.Methods A total of 200 residents who lived in Bashang area of Zhangjiakou for more than 10 years were selected from Jun.2015 to Jan.2017,including 100 healthy people(control group)and 100 patients with gastric carcinoma(gastric carcinoma group).Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique(PCR-RFLP)was applied to analyze the genetic typing of the two groups,and the correlation of single nucleotide polymorphism(SNP)rs3218625 of COX-2 with the risk of gastric cancer was analyzed by non-conditional logistic regression.Results The two groups showed no statistically significant difference in the proportion of subjects with age＜65 years(55.0%in the control group vs 58.0%in gastric carcinoma group),the proportion of males(70.0%vs 74.0%),and the proportion of subjects with continuous or occasional smoking history(47.0%vs 54.0%),P＞0.05.The proportion were 93.0%in the control group and 89.0%in gastric carcinoma group for GG of SNP rs3218625,5.0%and 10.0%for GA,2.0%and 1.0%for AA,and 7.0%and 11.0%for(AG+AA).Non-conditional logistic regression showed that COX-2 SNP rs3218625 was closely related with incidence of gastric cancer(OR=2.463,P=0.021).The higher the frequency of GA,the higher the risk of gastric cancer.Conclusion The COX-2 genetic polymorphisms can increase the risk of gastric cancer in Bashang area of Zhangjiakou,and the frequency of GA in SNP rs3218625 locus is a risk factor for gastric cancer.

Cyclooxygenase-2(COX-2);Single nucleotide polymorphism(SNP);Gastric cancer;Polymerase chain reaction(PCR)

R735.2

A

1003—6350（2017）19—3112—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.006

河北省2016年张家口市科学技术局与地震局项目(编号：1621049D)

邹建平。E-mail：zoujianping17@163.com

2017-04-26)