洁净室沉降菌监测影响因素分析

廖波 吴永智 肖莉

[摘要] 目的 对洁净室沉降菌监测中可能影响微生物生长的各种因素进行试验分析，找出一种行之有效的操作方法。方法 按《中国药典》2015年版四部9205要求对洁净室沉降菌进行监测。结果 培养方式、培养基的量、沉降碟暴露时间、沉降碟放置位置对最终监测结果均有一定影响。结论 对洁净室进行沉降菌监测时应综合考虑各种因素的影响，以得到最客观的监测结果。

[关键词] 洁净室；沉降菌；影响因素

[中图分类号] R155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）06（b）-0045-04

药品洁净实验室应定期进行微生物检测，内容包括非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测[1]。沉降菌监测不需要特殊仪器设备，方便、简单，可操作性强，是实验室和生产厂家采用得最多的方法。沉降菌监测照《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行[2]。微生物检测结果的可靠性在很大程度还依赖于操作者的技术及掌握熟练程度。因此，按系统控制风险的原理，在充分控制好各环节操作的前提下，培养基的制备就突出为影响检测结果的重要因素。目前市售的成品培养基基本用量在16 mL左右，培养时间大于3 d时普遍存在失水情况，影响检测结果的真实可信度。实验室用培养基多为自配使用的原因也正在于此，但据观察发现，因受实验室条件的限制，实验室人员在自制培养基时的随意较大，体现在取粉量和加水量的多少、还有加热时间和加热温度的不确定性、使用量的不均匀等影响因素。该文也是基于对自制培养基过程中风险因素的可控考虑，从配制用水所致的含水量高低、注入皿内培养基的基体用量等对培养生检测结果有影响的因素出发，以验证控制培养基配制条件的必要性。

1 仪器、设备与材料

1.1 仪器

全自动数显恒温鼓风干燥箱（GZX-9246MBE）；全自动数显生化培养箱（SPX-250B-Z）；全自动数显立式蒸汽灭菌器（YXQ.SJ41.280）；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型）；灭菌刻度吸管、试管、Q 90 mm×15 mm培养皿等。

1.2 设备

标准洁净室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基，批号20160121；胰酪大豆胨液体培养基，批号20160208；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号20160118；沙氏葡萄糖琼液体养基，批号20160302）。所有制备好的培养基均照《中国药典》2015年版（四部）1421“灭菌法”[1]操作，在121℃灭菌20 min。

1.4 验证试验用菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）]（贵州省食品药品检验所）。所有实验用菌种均为第三代。

2 方法

2.1 菌液制备

取经30～35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基培养物1 mL分别加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL的菌悬液备用。

取经20～25℃培养2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基培养物1 mL ，加入9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL 的菌悬液备用。

取经20～25℃培养5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖琼脂培养物，加2 mL 0.9%无菌氯化鈉溶液，洗下孢子，转移至另一空管，取1 mL 加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含孢子数小于100 cfu/mL 的孢子悬液备用。菌液计数结果见表1。

2.2 方法验证

培养基适用性检查：每次均以两个平皿在操作台暴露4 h作为阴性对照。比值计算公式：

2.2.1培養基失重情况考察（单位：g） ①取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）先在30～35℃常规预培养48 h后在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。结果见表2。

②取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后先在30～35℃预培养48 h后，在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。结果见表3。

2.2.2培养基量对微生物生长的影响 依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟45个（培养基加入量分别为：20、30、40 mL各15个），以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，取不同培养基量的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。结果见表4。

2.2.3暴露时间对微生物生长的影响 依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟60个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。分成4组，每组15个，在洁净室操作台均匀放置，动态暴露时间分布为1、2、3、4 h，取不同暴露时间的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。结果见表5。

2.2.4培养方式对微生物生长的影响 ①培养方式1：常规培养。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟15个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。结果见表6。

②培养方式2：密封培养。如①操作，以双层透明无菌袋包装烫封后续培养，结果见表6。

③培养方式3：加湿培养。如①操作，续培养期间于培养箱拖水盘中加入适量水或在培养箱中放入装水的烧杯，每天检查水量并及时补充，点计菌落数，取平均值计算比值。结果见表6。

3 讨论

3.1 培养基失重情况考察

因为采用的沉降碟不是终端灭菌，制备好后要100%进行预培养。常规预培养后依法操作，培养基总失重平均占比情况（失重率%）结果如表7。

说明采用密封预培养能明显减少预培养过程中的水分损失，同时在沉降菌监测中沉降碟不应放置于通风口附近。因为不同洁净室或生产车间环境条件不一样，受温度湿度及层流的风速的影响，培养基失重数据会有一定波动。

3.2 培养基量干扰培养结果

培养基为20、30、40 mL验证测得比值均在0.5～2范围内。但培养基量以30～40 mL为宜；20 mL量较少，水份损失后对微生物生长有一定影响，例如铜绿假单胞菌，比值仅为0.59；实际操作时不可能采用量器加培养基，加量不会很精准，多于40 mL已接近培养皿上沿，操作不当可能导致培养基溢出，同时黑曲霉培养5 d后已生成较为丰富的菌丝，如接触皿盖，造成计数困难，且孢子一旦逸出则会导致严重的环境污染。

3.3 通风口附近不宜放置沉降碟

培养时间在1～4 h之间各菌验证测得比值均在0.5～2之间，且同一种菌4个时间段的比值无显著性差异。说明采用密封预培养、高浇注培养基及避免在通风口附近放置沉降碟后，单向气流暴露4 h的水分损失不足以影响微生物的生长。

3.4 合理选择需氧或厌氧培养条件

对于许多需氧微生物而言，氧气是其呼吸作用的最终电子受体，对其生长至关重要[3]。在方式2的培养中，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉都是需氧菌，尤其是枯草芽孢杆菌在其生长过程中能迅速消耗环境中的游离氧，形成厌氧环境，使复苏迟缓的个体无法生长，故验证测得比值均低于0.5。只有金黄色葡萄球菌是需氧或兼性厌氧菌，在缺氧的环境中仍能维持验证测得比值在0.5～2范围内。

3.5 培养基含水量直接影响检出效率

水是所有生命形式都无法或缺的。水的可利用度是由材料或液体中的水活度来反映的（水活度为在同等温度和压力下，某种材料上方空间内的水蒸气与纯水上方空间内的水蒸气的压力之比）。革兰氏阴性菌不能在水活度低于0.97的环境中生长，而革兰氏阳性菌则可以在水活度0.8～0.98的环境中生长。在方式3的培养中，因为提高了培养环境的相对湿度（从34%提高到66%），有效地降低了培养基在培养过程中的水分损失，从而提高了培养环境中的水活度，有利于微生物的生长，所有对照菌的验证测得菌数均有明顯的提高，比值均提高到0.8以上。建议有条件的实验室在检测对象系对水含量敏感的菌类时，尽量在可调节和湿度的专业培养设备中完成培养，提高检出效率。

3.6 兼顾沉降碟采样时间与工作效能的平衡

考虑到单向气流暴露4 h，培养基水分损失后是否会影响微生物的生长，药典和GMP提出“单个沉降碟的暴露时间可以少于4 h，同一位置可使用多个沉降碟连续进行检测并累计计数”的方法，这一方法不适应于生产企业，非无菌产品和无菌产品的生产车间需控制面积大，采用累积计数法，沉降碟成倍增加，极大增加了工作量。

综上所述，密封预培养、高浇注培养基、远离通风口放置、加湿续培养的联合运用，既能满足《中国药典》2015年版和《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》对洁净室沉降菌监测的要求，又能使监测结果科学、客观、可靠。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] GB/T 16294-2010.医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法[S].北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会，2010.

[3] [英]S.P.德尼爾，等.药物微生物学[M].北京：化学工业出版社，2007：40，46.

（收稿日期：2017-03-13）