氧化石墨烯对人肺腺癌细胞的毒性产生的剂量效应

木 魁，李登坤，尚梦婷，葛文武，高祥志，姜双林*

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，安徽 阜阳 236037；3.亳州一中，安徽 亳州236800）

氧化石墨烯对人肺腺癌细胞的毒性产生的剂量效应

木 魁1,2，李登坤1,2，尚梦婷1,2，葛文武3，高祥志1，姜双林1,2*

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，安徽 阜阳 236037；3.亳州一中，安徽 亳州236800）

氧化石墨烯（GO）具有比表面积大、亲水性、溶液分散性好等独特的理化性质，而日趋广泛应用在生物医学。目前，在其低剂量下暴露细胞的生物安全性方面的报道很少，本实验选取GO，并对其理化性质表征。制备成浓度为0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL 使其暴露 24 h 在体外培养的人肺腺癌细胞 A549，检测胞内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT的活性，以及胞内的蛋白含量，荧光染色检测细胞产生的活性氧（ROS）的含量。MTT检测24 h、48 h、72 h细胞活性。结果表明，GO暴露24 h，8μg/mL对A549的活性具有最高促进作用。胞内SOD、CAT活性显著升高，蛋白含量增加，胞内ROS、MDA的含量降低。结论是GO对A549细胞活性具有双重性，低浓度下下调细胞内ROS，降低GO对A549的氧化损伤，从而提升细胞活性；高浓度下对细胞产生氧化损伤，抑制细胞活性。

氧化石墨烯；人肺腺癌细胞A549；细胞活性

氧化石墨烯（GO）凭借比表面积大、亲水性、灵活性、溶液分散性好等独特的理化性质被日益广泛的应用在肿瘤光热治疗、细胞成像、抗菌、药物输送和基因转染[1,2]。这些特点使得GO广泛的使用必然增加与人类的接触机会，尤其是呼吸系统，这也迫切需要对其生物安全性方面作出评估。

虽然有些研究表明GO具备生物安全性，但也有很多研究证明其存在危害性。这其中有很多不确定因素，比如横向尺寸、厚度、所含官能团种类和数量这些精确的理化性质，以及暴露的GO的量，培养细胞的浓度等。Hu等[3]用20μg/mL和85μg/mL的GO暴露A549细胞24h，20μg/mL的GO对细胞无毒性，细胞略有减少，85μg/mL的GO细胞毒性增加，细胞减少50%。Chang等[4]研究表明，进入不了A549细胞的GO无明显毒性，高浓度的GO对A549细胞引起剂量依赖性氧化压力，从而诱导细胞存活力的略微降低。然而在实际应用过程中，多数使用的GO是低浓度的，高浓度的研究对应用并没有很高指导意义。

本实验通过体外对A549细胞暴露于低剂量GO下，分析各种生化指标，得出低浓度GO对A549细胞的促进作用。在体外模拟GO的生物安全性，从而为体内GO的使用剂量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞（中国科学院生态环境研究中心馈赠）、氧化石墨烯GO（中国科学院生态环境研究中心馈赠）

1.2 试剂

A549细胞培养液：RPMI1640培养基（南京建成生物工程研究所）、10%标准胎牛血清（南京建成生物工程研究所）、胰蛋白酶（Sigma）、噻唑蓝（MTT，上海生工）、三联溶解液（10%SDS，5%异丁醇，0.01 mol/L HCL）、超氧化物歧化酶（SOD）制剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、活性氧（ROS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、总蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 实验方法

1.3.1 GO的表征

原子力显微镜（AFM）和透射电镜（TEM）表征GO的粒径大小和形状，傅氏转换红外线光谱分析仪分析GO所包含的官能团。

1.3.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的的RPMI1640完全培养基，在CO2为5%，温度为37℃的CO2培养箱中培养A549细胞。

1.3.2 细胞活力检测

将GO用含10%胎牛血清的完全培养基稀释制成1mg/mL的浓储备液，分别稀释成终浓度为2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL及不加GO的完全培养基作为空白对照，取对数期A549细胞经过0.25%的胰酶消化、离心、去上清、重悬、计数，密度制备成1×105个/mL，在96孔板上每个浓度设置四个重复和一个空白孔，分别培养24h，48 h，72h。每孔加入MTT10μL后继续37℃孵育4h，加入三联溶解液100μL再次37℃孵育4h，直接在570nm处用酶标仪（Invitrogen）测量光度值。

1.3.3 细胞生化指标的检测

A549细胞分别暴露在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下24h，收集上清按照LDH试剂盒说明书操作，弃上清的细胞经过裂解液裂解收集，按照CAT、SOD、总蛋白定量试剂盒进行操作。

1.3.4 细胞内活性氧含量的检测

A549细胞分别暴露在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下24h，加入DCFH-DA探针，37℃孵育1h，消化离心收集细胞，进行重悬后进行荧光检测。

1.4 统计分析

数据图表分别使用GraphPad Prism和Origin8.0软件分析。差异显著性用2way ANOVA分析方法进行比较。

2 结果

2.1 GO理化性质表征

实验对GO的理化性质进行表征，表1对GO表面的官能团进行量化统计。结果表明，GO具有非常丰富的含氧官能团，含氧官能团占总体的65%左右，说明其水溶性非常好，在水中能稳定存在，能够有很强的吸附性能。图1A中透射电镜TEM表征GO的横向尺寸，图1B用原子力学显微镜AFM表征GO外形，结果显示，其横向尺度分布95%在750～1 300 nm，厚度为1 nm。

表1 氧化石墨烯GO官能团的组成及相对含量

图1 材料氧化石墨烯GO表征A为透射电镜图像；B为原子力显微镜下GO的形态；C原子力显微镜分析GO的高度

2.2 GO对A549细胞活性的影响

如图 2，在0～8μg/mL浓度下A549细胞随GO浓度升高，细胞活性升高，8μg/mLGO时A549细胞活性最好，24 h细胞活力提升26.45%，继续增加GO浓度，细胞活性受到抑制，72 h最大抑制率为59.53%。在不同时间下，细胞活性趋势一致。说明GO对A549细胞的作用具有双重性，低浓度下促进细胞活性，高浓度下抑制细胞活性。

图2 GO不同浓度和时间节点对A549的活性影响

2.3 GO对A549细胞生化指标的影响

如图 3A，在 0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下暴露A549细胞24h，细胞总蛋白的浓度先升高后降低，在8μg/mL是，总蛋白含量最高，是空白对照的2.5倍，间接证明细胞的数量在8μg/mL最高。32μg/mL时蛋白含量为空白对照的71%，可知在此浓度下细胞的数量受到抑制，有所降低。如图3B，在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下暴露A549细胞24 h，处理组CAT活力显著低于对照组（p＜0.05），并随GO浓度增大而活力降低，当浓度达到32μg/mL时，CAT活力仅为对照组的9.45%，说明GO能显著影响过氧化氢酶活性，从而对A549细胞活性产生抑制。

如图3C，0～32μg/mL浓度下的GO，SOD活力先降低后升高，在8μg/mL时SOD活力最低，为对照组的40.5%，由于GO引起A549细胞内活性氧升高，胞内SOD能清除少量产生的活性氧，从而保护细胞，减少损伤。但随着GO浓度在短期大量增加，胞内活性氧大幅产生，诱导细胞代偿应激，A549细胞会诱导性增强抗氧化能力，出现SOD水平增高。当32μg/mL时，SOD含量是对照组的2.06倍。如图3D，0～32μg/mL浓度下的GO，MDA含量先降低后升高，在8μg/mL时MDA含量最低，为对照组的75.51%，说明细胞内的脂质过氧化降低；随着GO浓度升高，A549细胞内的MDA含量显著升高，在32μg/mL时MDA含量是对照组的1.54倍，说明A549由于氧化压力导致细胞损伤。

2.4 GO对A549细胞内ROS的影响

如图4、图5，0～32μg/mL浓度下的GO对A549细胞内ROS的产量先升高后降低，在8μg/mL的GO作用时，ROS含量最低，仅为对照组的24.32%。0～32μg/mL的GO浓度下，CAT活力呈递减趋势，结合SOD活力分析，在0～8μg/mL浓度的GO，A549细胞内活性氧（ROS）与CAT、SOD活力处于一种相对平衡状态，ROS的水平更低，细胞活力因此得到提高。在8～32μg/mL浓度的GO，A549细胞内的CAT活力继续降低，ROS含量与SOD活力升高，处于急性毒性刺激下的诱导代偿升高，细胞活力受到抑制。

图3 不同浓度GO对A549细胞内生理生化指标影响

图4 GO对A549细胞内产生的ROS影响

图5 不同浓度GO对A549作用荧光强度影响

3 讨论

氧化石墨烯GO凭借其独特的理化性质，被日益广泛地应用在生物医学领域，必然增加更多机会暴露接触人类，尤其是肺部。其生物安全性评估更加刻不容缓。本次实验选用较低浓度的GO通过体外实验，模拟人肺部暴露GO，选取的细胞是人肺腺癌细胞A549，来源于58岁的白人男性肺癌组织，A549具有培养简单，对异物暴露刺激敏感性高，可重复性强，是比较理想的体外毒理学模拟肺部损伤的细胞。

通过细胞活性经典实验MTT法检测GO对A549活性的影响[5]，通过计算得出A549在不同时间点，不同浓度下GO暴露的存活率。结果表明，GO对A549的活性具有双重性，低浓度下促进细胞生长增殖，而高浓度下抑制细胞活性，其中8μg/mL的GO对A549细胞活性最高。通过对不同浓度GO处理的A549进行裂解测蛋白含量的结果也间接证明在8μg/mL的GO下的A549细胞数量最多，并且蛋白浓度与细胞活性的趋势一致。

研究表明纳米颗粒引起的活性氧（ROS）可能是纳米颗粒产生细胞毒性的主要原因之一[6]。胞内过量的活性氧ROS是细胞内的氧化压力增大造成的，对核苷酸产生损伤，导致DNA断裂[7]，而超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT是清除体内的超氧阴离子和过氧化氢，从而减少氧化压力，减少细胞的DNA损伤[8]。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度。实验结果表明，0～32μg/mL 浓度下的 GO、CAT 活力递减，ROS、MDA和SOD趋势一致，都是先降低后升高。综上，0～8μg/mL浓度的GO对A549细胞的影响其中一个主要的原因是细胞内ROS的下调，从而降低胞内的活性氧对细胞的毒性。

以往研究重心多集中在高浓度的GO对细胞或动物的损伤方面，还有一些研究证明GO是生物安全性方面，鲜有研究报道其对细胞或动物促进方面，对于GO促进A549细胞的机制尚不清楚[9-10]。可能与GO材料本身具有丰富的含氧官能团，水溶性好，吸附性强有关，其能通过吸附代谢废物从而降低细胞自身代谢的毒害物质，或者材料本身具有的官能团能与A549细胞膜表面的蛋白反应，通过信号转导调节代谢，产生抗氧化酶，清楚胞内自由基离子，从而保护细胞。

综上所述，氧化石墨烯GO对A549细胞的作用具有两重性，低浓度下降低胞内活性氧，促进细胞活性；高浓度下产生氧化应激，对细胞产生毒性，而其对细胞促进方面的机制尚不清晰，需要进一步探讨研究。

[1]Gonçalves G,Vila M,Portolés M T,et al.Nano-graphene oxide：a potential multifunctional platform for cancer therapy[J].Advanced Healthcare Materials,2013,2(8)：1072-1090.

[2]Byun J.Emerging frontiers of graphene in biomedicine[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,25(2)：145-151.

[3]Hu W,Peng C,Luo W,et al.Graphene-based antibacterial paper[J].ACS Nano,2010,4(7)：4317-4323.

[4]Chang Y,Yang S T,Liu J H,et al.In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells[J].Toxicology Letters,2011,200(3)：201-210.

[5]Sayes C M,Wahi R,Kurian P A,et al.Correlating nanoscale Titania structure with toxicity：a cytotoxicity and inflammatory response study with human dermal fibroblasts and human lung epithelial cells[J].Toxicological Sciences：an Official Journal of the Society of Toxicology,2006,92(1)：174-185.

[6]Panas A,Comouth A,Saathoff H,et al.Toxic potential of materials at the nanolevel[J].Science,2014,311(5761)：622-627.

[7]吴 凯，杨光涛，娄小华，等.甲醛致小鼠肺DNA蛋白质交联和DNA断裂效应的研究[J].公共卫生与预防医学，2006，17（2）：15-18,21.

[8]Kinnula V L.Oxidant and antioxidant mechanisms of lung disease caused by asbestos fibres[J].The European Respiratory Journal,1999,14(3)：706-716.

[9]Feng L,Liu Z.Graphene in biomedicine：opportunities and challenges[J].Nanomedicine(London,England),2011,6(2)：317-324.

[10]Seabra A B,Paula A J,De Lima R,et al.Nanotoxicity of graphene and graphene oxide[J].Chemical Research in Toxicology,2014,27(2)：159-168.

Dose effect of graphene oxide on the toxicity of human lung adenocarcinoma

MU Kui1,2,LI Deng-kun1,2,SHANG Meng-ting1,2,GE Wen-wu3,GAO Zhi-xiang1,JIANG Shuang-lin1,2*
(1.School of Biological and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation in Anhui，Fuyang Anhui236037,China;3.No.1Middle School of Bozhou,Bozhou Anhui236800,China)

Oxidized graphene(GO)has the unique physical and chemical properties,such as large specific surface area,good hydrophilicity and good solution dispersion,so it is widely used in biomedicine.At present,there are few reports on the biosafety of exposed cells at low doses.GO is selected in this experiment and its physicochemical properties are characterized.The cells were incubated for 24 h in human lung adenocarcinoma cell line A549.Preparation of human lung adenocarcinoma cell A549 in vitro at a concentration of 0μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL and 32μg/mL for 24 h,the activity of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),catalase(CAT)and the content of intracellular protein were measured and the content of reactive oxygen species(ROS)was detected by fluorescence staining.MTT assay 24 h,48 h,72 h cell activity.The results showed that at 24 h,8μg/mL of GO exposure had the highest promoting effect on the activity of A549.Intracellular SOD and CAT activities were significantly increased,protein content increased,intracellular ROS and MDA content decreased.Con-clusion：GO has dual effects on A549 cell activity,down-regulating intracellular ROS and decreasing oxidative damage of GO onA549 cells,thus enhancing cell viability.High concentration will produce oxidative damage to cells,and inhibit cell activity.

graphene oxide;human lung adenocarcinoma cell lineA549;cell activity

文献标识码： 文章编号：1004-4329（2017）03-044-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）03-044-05

2017-06-02

国家自然科学基金重大研究计划项目（91643113）；安徽省教育厅重点项目（20528110203）；国家级大学生创新创业项目（20251000314）资助。

木 魁（1990- ），男，硕士生，研究方向：环境毒理。

姜双林（1963- ），男，硕士，教授，研究方向：环境毒理。Email：jiangshuanglin87@163.com。