实体器官移植失败患者HLA和HPA抗体筛查及特异性分析

陈大伟，夏文杰，徐秀章，邓晶，叶欣

(广州市广州血液中心，广东 广州 510095)

实体器官移植失败患者HLA和HPA抗体筛查及特异性分析

陈大伟，夏文杰，徐秀章，邓晶，叶欣

(广州市广州血液中心，广东 广州 510095)

目的 了解广州地区实体器官移植失败患者中HLA抗体和HPA抗体的分布和特异性，初步探索HLA抗体及HPA抗体与实体器官免疫性排斥反应的相关性。方法 随机收集广州地区实体器官移植失败患者标本136例，利用Lifecodes LifeScreen Deluxe（LMX）筛查标本的HLA抗体，阳性者再分别利用LIFECODES LSATMClassⅠ和LIFECODES LSATMClassⅡ（Single Antigen）鉴定抗体特异性；利用Lifecodes PAKR 2LE对HPA抗体进行筛查，阳性标本利用MAIPA进行最终确证。结果 广州地区136例实体器官移植失败患者中，抗-HLA阳性率55.15%（75/136），其中HLA-Ⅰ类抗体出现频率为38.97%（53/136），HLA-Ⅱ类抗体出现频率为42.65%（58/136）。HLA-Ⅰ类抗体中出现频率较高的分别是抗-A*02 35.85%（19/53）、 抗-B*15 47.17%（25/53） 和抗-Cw*07 28.30%（15/53），HLA-Ⅱ类抗体出现频率最高者是抗-DRB1*04 39.66%（23/58）和抗-DQB1*03 46.55%（27/58）。此外，检出HPA-5bb抗体一例。结论 初步探讨了广州地区实体器官移植失败患者HLA抗体及HPA抗体的分布情况，证实HLA抗体与移植后的免疫排斥反应密切相关。

实体器官移植；HLA抗体；HPA抗体；抗体筛查；抗体特异性

近年来越来越多的研究表明，抗体介导的体液排斥反应在移植物损伤过程中发挥着十分重要的作用。实体器官移植受者在接受了HLA不同的移植物后，体内产生抗HLA抗体而成为致敏状态。致敏不但与急性排斥有关，而且与慢性排斥及长期存活率也有关[1，2]。术前对HLA抗体进行检测已是国内外移植配型中心的常规，但是对术后HLA抗体的监测尚未引起广泛关注。移植后特异性HLA抗体的产生可增加移植物急、慢性排斥反应，缩短移植物的生存周期。本文拟通过检测实体器官移植失败患者抗人类白细胞抗原（HLA）抗体和抗人类血小板（HPA）抗体，了解广州地区实体器官移植失败患者体内HLA抗体和HPA抗体的分布情况，初步探索移植失败与HLA抗体和HPA抗体之间的关系，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象的选择随机选取广州血液中心临床输血研究所2012年至2015年间，实体器官移植失败患者136例，其中男性74例，女性62例，年龄39.4±13.5岁，作为实验对象，采集静脉全血10ml，EDTA 抗凝。

1.2 试剂与仪器LifeScreen Deluxe（美国Lifecodes，批号：3000383），LSATMClassⅠ（美国 Lifecodes，批号：09172B）和 LSATMClassⅡ（美国 Lifecodes，批号：10102A），PAKR 2LE（美国 Lifecodes，批号：3000205），配套仪器 Luminex（美国 Lifecodes，型号：Luminex 200）；酶标板 （英国Multiscreen，批号：R2KA41796），酶标仪（美国 Biotek，型号：ELX800GTI）；水平摇床 （美国Orbital，型号：MX100-4A）；真空泵（美国 Millipore，型号：WP6122050）。

1.3 抗体检测

1.3.1 HLA抗体筛查利用LifeScreen Deluxe（LMX）试剂盒进行检测。在酶标板中，每孔依次加入 20μl洗液、2.5μl磁珠和 7μl待测标本血清或对照血清，混匀，室温下置于摇床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入 60μl洗液，混匀，转移至过滤板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重复操作2次；每孔加入25μl稀释为1×的浓缩酶联物 (10×的结合了藻红蛋白的羊源抗人类IgG抗体)，室温下，置于水平摇床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重悬磁珠。利用Luminex仪器收集数据，采用分析软件Launch MatchIT（version 1.00）中的 LifeScreen 进行分析。

1.3.2 HLA抗体特异性分析根据HLA抗体筛查的情况，阳性标本分别进行HLA-Ⅰ抗体和HLA-Ⅱ抗体特异性分析。利用LSATM ClassⅠ/Ⅱ（LSA）试剂盒进行特异性分析。在酶标板中，每孔依次加入20μl LSA磁珠和7μl待测标本血清或对照血清，混匀，室温下置于摇床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入60μl洗液，混匀，转移至过滤板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重复操作2次；每孔加入25μl稀释为1×的浓缩酶联物，室温下，置于水平摇床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重悬磁珠。利用Luminex仪器收集数据，采用分析软件Launch MatchIT（version 1.00）中的 Single Antigen 进行分析。

1.3.3 HPA抗体筛查用超纯水将浓缩洗液稀释为1×工作液，将待检血浆和对照血清稀释到工作浓度；取出微孔板加工作液300μl进行清洗，按事先安排加入50μl质控血清和待检血清，37℃水浴30min，洗板，除空白对照孔，其余加入1：100稀释的酶结合物 50μl，37℃水浴 30min，洗板，加入稀释的 PNPP 100μl，避光孵育 30min，加入 100μl终止液终止反应，空白孔加入200μl终止液，用酶标仪在405或者410nm处读取各孔吸光度。

1.3.4 HPA抗体确证利用血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测（MAIPA）进行HPA抗体的确证。用coating buffer将羊抗人IgG稀释包被于96孔平底板中，4℃孵育过夜；采集已知HPA特异性的O型供者全血，分离血小板；根据实验需要的格局，向96孔U型板中加入相应的血小板悬浮液，100μl/孔； 加入待检血浆，25μl/孔， 震荡混匀，37℃孵育30min；利用TBS/BSA缓冲液去除未结合的免疫球蛋白；利用TBS/BSA缓冲液稀释鼠抗人单克隆抗体，加入U型板中，40μl/孔，重悬血小板；利用TBS/BSA缓冲液去除未结合的单克隆抗体；向U型板中加入Solubilization缓冲液，4℃孵育30min，充分裂解血小板膜；从U型板上清中吸取100μl裂解液，加入已包被的平底板相应的孔中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未结合的裂解蛋白；将过氧化物标记的羊抗人IgG用Tween洗液按 1：6000 稀释，100μl/孔加入平底板中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未结合的酶标抗体；每孔加入100μl OPD溶液，室温显色20-30min，每孔加入100μl终止液终止反应；用酶标仪读板，波长490mm。

2 结果

2.1 实体器官移植失败患者HLA抗体筛查情况136例实体器官移植失败患者，HLA抗体阳性率为55.15（75/136），男性患者中HLA抗体阳性率为51.35（38/74），女性患者中HLA抗体阳性率为59.68（37/62），见表 1。

2.2 实体器官移植失败患者HLA抗体特异性分析分别对53例HLA-Ⅰ类抗体阳性和58例HLA-Ⅱ类抗体阳性的患者进行HLA抗体特异性分析。HLA-I类抗体中出现频率较高的有A*24、A*02、B*15、B*35、Cw*07 和 Cw*17 等，见表 2，3。

表1 实体器官移植失败患者HLA抗体筛查结果（%）

2.3 实体器官移植失败患者HPA抗体筛查及特异性分析对136例血清进行HPA抗体筛查及特异性分析，仅发现一例HPA抗体阳性，经MAIPA鉴定为HPA-5bb抗体，合并出现HLA抗体。

3 讨论

人类白细胞抗原（HLA）是介导器官移植排斥反应的主要分子，患者在多次输血、妊娠或者移植后受到同种HLA免疫致敏可产生群体反应性抗体（PRA），且影响移植物长期存活[3]。一项多中心研究表明术后出现HLA抗体的受者移植肾功能丧失的发生率明显高于未出现抗HLA抗体的患者[4]。邓晶[5]等对广州地区无偿献血员HLA抗体的分布进行研究，发现其HLA抗体出现的频率为3.53%（13/368）。本研究对广州地区2012年至2015年间136例实体器官移植失败的患者进行HLA抗体分布调查，发现实体器官移植失败的患者HLA抗体频率为55.15%（75/136），与广州地区无偿献血员[5]相比差异明显，有统计学意义。

表2 53名实体器官移植失败患者HLA-Ⅰ类抗体的特异性

表3 58名实体器官移植失败患者HLA-Ⅱ类抗体的特异性

Harris PE[6]等研究发现抗HLA-I类抗体可降低移植肾存活率，并能明显增加排斥反应的发生，而HLA-II类抗体对移植肾的长期存活可能有影响。不同区域和种族之间HLA抗原分布不同，地域抗原的特异性导致HLA抗体分布的差异，高频抗原诱发产生高频抗体[7]。本试验中出现频率较高的HLA-I类特异性抗体分别有 HLA-A*11，A*23，B*18，B*14，Cw*03和Cw*12等，对照本实验室建立的健康献血者血小板HLA基因库[8]，抗体特异性与基因库中频率较高的特异性抗原基本一致。此外，研究表明HLA-DRB1与多种自身免疫性疾病和感染性疾病相关，还与器官移植前供者与受者的配型相关[9，10]。目前，世界卫生组织命名的HLADRB1等位基因超过了460种，具有高度的多态性，与种族，地域有一定的相关性，各地区又有其自身的特点[11-13]。孙瑜等[14]对江西地区汉族造血干细胞志愿捐献者的HLA-DRB1基因多态性进行了分析研究，其中基因频率最高的是DRB1*04（15.2%）。

Gorgi Y[15]等对法国地区肾移植与人血小板抗原多态性之间的关系进行研究，发现位于GPIIb/IIIa糖蛋白上的HPA-4b作为一种独立的风险因素，可影响肾移植的排斥反应。根据夏文杰等[16]对广东地区无偿献血者HPA基因型的调查发现，广东地区HPA-4b出现的频率为0，故暂不必考虑其对器官移植的影响。根据Kotzampasaki EM等[17]对HPA-5的研究发现，HPA-5错配可能会导致移植后移植物抗宿主病的发生。本研究中，在实体器官移植失败的患者中发现一例HPA-5bb抗体合并HLA抗体。考虑到HPA抗体对实体器官移植的影响尚未达到统一认可，而且本研究患者例数较少，拟通过扩大样本量进行进一步的研究。

众多研究表明，HLA抗体是实体器官移植的高危因素，本研究亦发现实体器官移植失败患者中HLA抗体出现的频率明显高于普通人群，再次证实HLA抗体与器官移植之间的密切关系。

[1]Vasilescu ER，Ho EK，Colovai AI，et al.Alloantibodies and the outcome of cadaver kidney allografts[J]．Hum Immunol，2006，67(8)：597-604．

[2]Lefaucheur C，Nochy D，Hill GS，et al.Determinants of poor graft outcome in patientswith antibody－mediated acute rejection[J]．Am JTransplant，2007，7(4)：832-841.

[3]Hyun J，Park KD，Yoo Y，et al.Effects of different sensitization events on HLA alloimmunization in solid organ transplantation patients[J].Transplant Proc，2012，44(1)：222-225.

[4]Terasaki PI，Ozawa M.Predicting kidney graft failure by HLA antibodies：a prospective trial[J].Am JTransplant，2004，4：438-443.

[5]邓晶，叶欣，夏文杰，等.广州地区无偿献血者抗体筛查和特异性分析初探[J].中国输血杂志，2012，2(1)：36-37.

[6]Harris PE，Cortesini R，Suciu-Foca N.Indirect allorecognition in solid organ transplantation[J].Rev Immunogenet，1999，1(3)：297-308.

[7]袁方，孙玉英，梁飞，等.我国部分省份(地区)汉族人群HLA-I类基因多态性地区差异分析 [J].中国医药生物技术，2008，3(5)：343-349.

[8]叶欣，夏文杰，付涌水，等.血小板HLA供者库的建立和应用[J].中华血液学杂志，2009，30(3)：198-200．

[9]Handunnetthi L，Ramagopalan SV，Ebers GC，et al.Regulation of major histocompatibility complex class II gene expression，genetic variation and disease[J].Genes Immun，2010，11(2)：99-112.

[10]Ando T，Ishikawa T，Kato H，et al.Synergistic effect of HLA class II lociand cytokine gene polymorphisms on the risk of gastric cancer in Japanese patientswith Helicobacter pylori infection[J].Int J Cancer，2009，125(11)：2595-2602.

[11]吴江东，卢丽君，左维泽，等.新疆地区汉族和维吾尔族部分人群HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1基因多态性与单倍型的比较[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32(4)：518-522.

[12]刘晓华，冯智慧，胡彬，等.山东半岛地区汉族人群HLA-A、B、DRB1高分辨等位基因及单体型多态性的研究 [J].中国输血杂志，2010，23(8)：592-595.

[13]杨剑豪，刘嬿，郑皆炜，等.4082名上海骨髓库汉族无关供者HLA_A_B_DRB1高分辨等位基因及单体型多态性研究[J].中国输血杂志，2012，25(12)：1262-1267.

[14]孙瑜，彭继红，李国良.江西地区1927例骨髓捐献人群HLAA、B、DRB1 的多态性探讨 [J].实验与检验医学，2014，32(6)：661-663.

[15]Chapman CE，Stainsby D，Jones H，et al.Ten years of hemovigilance reports of transfusion-related acute lung injury in the United Kingdom and the impact of preferential use ofmale donor plasma[J].Transfusion，2009，49(3)：440-452.

[16]夏文杰，叶欣，陈扬凯，等.血小板HPA基因库的建立和初步应用[J].中华血液学杂志，2009，30(1)：54-56.

[17]Kotzampasaki EM，Spyropoulou-Vlachou MS，Kalofoutis C，et al.Minor histocompatibility antigen HA-1 and HPA-5 polymorphisms in HLA-identical related bonemarrow transplantation[J].Transplant Proc，2004，36(6)：1735-1738.

Screening and analysis of HLA and HPA antibodies in patients w ith failed solid organ transplantation

CHEN Dawei，XIA Wenjie，XU Xiuzhang，DENG Jing，YE Xin.
Guangzhou Blood Center，Guangzhou 510095，China.

Objective To elucidate the distribution of HLA/HPA antibodies in patients with failed solid organ transplantation in Guangzhou and identify the specificities of the HLA/HPA antibodies.To explore the relationship between HLA/HPA antibodies and rejection reaction of organ transplantation preliminarily.M ethods Random ly collected blood samples of 136 patients with failed solid organ transplantation.Screened all sampleswith Lifecodes LifeScreen Deluxe(LMX)for HLA antibody test and carried out the antibody specificity detection in the positive samples with LIFECODES LSATMClass I and LIFECODES LSATM Class II(Single Antigen)；Screened all sampleswith Lifecodes PAKR 2LE for HPA antibody testand carried out the antibody specificity detection in the positive sampleswith MAIPA.Results Among 136 patientswith failed solid organ transplantation in Guangzhou，the positive rate of HLA antibodies was 55.15%(75/136)，the frequency of HLA-I antibody and HLA-II antibody were 38.97%(53/136)，42.65%(58/136).The highest frequencies of HLA-I alloantibodies were anti-A*02 35.85%(19/53)，anti-B*15 47.17%(25/53)，anti-Cw*07 28.30%(15/53)，while themost HLA-IIalloantibody were anti-DRB1*04 39.66%(23/58)and anti-DQB1*03 46.55%(27/58).Besides，HPA-5bb antibody was detected in only one sample.Conclusion The study obtained the information about the frequency of HLA/HPA antibodies in the failed patientswith solid organ transplantation in Guangzhou，and the HLA antibodies were closely related to the immune rejection after transplantation.

Solid organ transplantation；HLA antibody；HPA antibody；Antibody screening；Specificities of antibodies

R446.62，R617

A

1674-1129(2017)05-0646-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.004

广东省医学科学技术研究基金项目（A2016616），广州市医药卫生科技项目（20171A011281），广州市科技计划项目（201707010021）。

陈大伟，男，1988年生，硕士研究生，主要从事血小板免疫方面的研究。

叶欣，女，1968年生，主任医师，主要从事HLA抗原抗体检测及血小板免疫方面的研究。

2017-04-14；

2017-08-10)