广州地区正常儿童血清维生素B12参考区间调查

黄钰君++++++伍绍国++++++丘媛媛++++++蔡敏敏++++++陈慧敏+++++++黎彦攸

[摘要] 目的 建立广州地区健康儿童血清维生素B12（VB12）参考区间。 方法 应用LK3000V维生素检测仪对2015年9月～2016年12月广州地区2065名健康儿童（男1208名，女857名）和129名成年人（男52名，女77名）的血清VB12水平进行检测，对结果进行统计分析。 结果 11岁以内的11个年龄组、11～17岁组男、女血清VB12水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。0～2岁、>2～5岁和>7～17岁、>5～7岁、>17岁血清VB12水平中位数（P2.5，P97.5）分别为252.4（192.3，338.0）、253.1（192.5，359.5）、262.7（194.8，374.9）、297.5（233.7，383.1） pg/mL，兩两比较差异有统计学意义（P < 0.05）。年龄与血清VB12水平的相关系数（r值）为0.228（P=0.000）。 结论 广州地区正常儿童血清VB12水平参考区间2岁以内为192.3～338.0 pg/mL，>2～5岁和>7～17岁两个年龄段为192.5～359.5 pg/mL，>5～7岁为194.8～374.9 pg/mL。

[关键词] 参考区间；维生素B12；广州地区；儿童

[中图分类号] R179 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0114-05

Investigation on the normal reference range of healthy children serum Vitamin B12 in Guangzhou

HUANG Yujun1 WU Shaoguo2 QIU Yuanyuan3 CAI Minmin4 CHEN Huimin5 LI Yanyou6

1.Department of Laboratory Medicine， Guangzhou Children's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510120， China； 2.Department of Laboratory Medicine， Guangzhou 12th People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510620， China； 3.Department of Laboratory Medicine， Guangzhou Maternity Health Care Center， Guangdong Province， Guangzhou 510120， China； 4.Department of Laboratory Medicine， Zhujiang New Town Branch of Guangzhou Women and Children Medical Center， Guangdong Province， Guangzhou 510620， China； 5.Department of Clinical Nutrition， Zhujiang New Town Branch of Guangzhou Women and Children Medical Center， Guangdong Province， Guangzhou 510620， China； 6.Tianjin Lanbiao Science and Technology Ltd.， Tianjin 300384， China

[Abstract] Objective To establish the normal reference range of healthy children serum Vitamin B12 （VB12） in Guangzhou. Methods Levels of serum VB12 of 2065 healthy children （1208 boys and 857 girls） and 129 adults （52 male and 77 female） living in Guangzhou Region were examined by LK3000V Vitamin Analyzer from September 2015 to December 2016. The results were analyzed statistically. Results There were no statistical differences in levels of serum VB12 between boys and girls in 11 age groups （aged less than 11） and 11-17 age group （P > 0.05）. The median （P2.5， P97.5） levels of serum VB12 defined by age were 252.4 （192.3， 338.0） pg/mL of 0-2 years-old group， 253.1 （192.5， 359.5） pg/mL of >2-5 years-old group as well as >7-17 years-old group， 262.7 （194.8， 374.9） pg/mL of >5-7 years-old group， 297.5 （233.7， 383.1） pg/mL of >17 years-old group， there were statistically significant differences between any two groups （P < 0.05）. Positive correlation was found between age and level of serum VB12 （r=0.228， P=0.000）. Conclusion Reference ranges of healthy children serum VB12 in Guangzhou Region are showed as follows： 192.3-338.0 pg/mL of 0-2 years-old children， 192.5-359.5 pg/mL of >2-5 years-old as well as >7-17 years-old children， and 194.80-374.9 pg/mL of >5-7 years-old children.

[Key words] Reference range； Vitamin B12； Guangzhou Region； Children

维生素B12（vitamin B12，VB12）是儿童正常生长发育而所必需的微量营养素之一，对血液系统成熟、神经系统的发育有重要作用。典型的VB12缺乏导致巨幼细胞性贫血，但通常没有贫血症状的隐性VB12缺乏者若治疗不及时将造成不可逆的神经系统损害，如记忆力减退、学习成绩和认知能力下降、行为异常等[1]。儿童早期VB12缺乏可能仅表现为体质虚弱、发育迟缓等非特异性的症状，临床诊断较困难，因此早期诊断并及时治疗是预防长期神经系统并发症的关键[2]。然而，迄今未有诊断VB12缺乏的金标准，血清VB12作为目前判断机体VB12水平的一线指标，是首选标准常规诊断试验[3]。正确的参考区间是判断血清VB12是否缺乏的前提。国内外研究均显示，正常人群血清VB12水平存在着明显的人种、地区、性别、年龄间差异，各地应该建立当地的参考范围[4-9]。国内有关正常人群VB12参考区间的研究多数基于成年人群，较少见儿童人群的报道，尤其欠缺对正常儿童按年龄、性别进行分层的大样本系统研究。本文按照美国临床实验室标准化委员会C28-A的要求[10]，通过检测分析表观“健康”儿童血清VB12的水平，以期建立广州地区儿童人群本实验室的正常参考区间，同时为临床早期发现儿童VB12缺乏进而及时治疗提供判断标准，也为其他实验室参考本地区正常儿童VB12水平提供循证医学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2015年9月～2016年12月在广州市妇女儿童医疗中心、广州市儿童医院、广州市妇婴医院、广州市第十二人民医院进行健康查体的儿童2065名，均肝肾功能正常、血尿常规正常及其他体检结论为“健康”，同时经问卷调查无任何慢性病史、代谢病史，采集标本前1个月内无急性病，采集标本前2周未服用任何处方药。其中，男1208名，女857名。同时招募健康成年人129名作为成年人对照，其中，男52名，女77名。研究经广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 仪器与试剂

仪器为天津市兰标电子科技发展有限公司生产的LK3000V维生素检测仪；试剂为兰标公司生产的配套试剂盒（样品处理液、定标液、质控品等）。

1.3 方法

1.3.1维生素B12检测 各医院标本统一送至广州市儿童医院检验科检测。抽取受试者空腹静脉血3 mL，置不含添加剂的一次性真空采血管，3000 r/min离心10 min，取40 μL血清标本（或质控品）加入盛有2 mL VB12样本处理液的样品管中，颠倒混匀后放在工作台旋转杯中，选择检测项目进行检测。

1.3.2 参考区间验证实验 按照所建参考区间的年龄分组，分别重新随机选取相应年龄体检结论为“健康”的男女各10名测定VB12，对所建立的参考区间进行验证。

1.4 统计学方法

采用IBM SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，所有分组比较数据均采用One sample Kolmogorov-Smirnov Test法做正态性检验。正态分布数据表示形式为均数±标准差（x±s），两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t（方差齐）或Tamhane's T2法（方差不齐）；非正态分布数据表示形式为中位数（四分位数）[M（P25，P75）]采用非参数检验：多组间比较用Kruskal-Wallis法，两两比较采用Mann-Whitney法。去除离群值用Tukey's法，参考区间用（P2.5，P97.5）表示。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2065名健康儿童各年龄组两性间血清VB12水平比较

由表1可见，17岁及以下各年龄组男性与女性血清VB12水平差异均无统计学意义（P > 0.05），故可以合并性别后按年龄组进行比较。

2.2 各年龄组、合并部分年龄组后血清VB12水平

由表2可见，总体判断各组间差异有统计学意义（P < 0.05），但两两比较并非所有组间差异均有统计学意义。因此，本研究将水平差异无统计学意义的年龄组进行合并后行方差分析或非参数检验比较，直至组间两两比较差异均有统计学意义，最终分成0～2岁、>2～5岁和>7～17岁、>5～7岁、>17岁四组。见表3。

2.3 血清维生素B12水平与年龄的相关性分析

血清VB12水平与年龄的相关系数（r值）为0.228（P=0.000）。

2.4 简单验证参考区间实验

选取的60名来自3个年龄段的血清VB12检测结果全部在相应年龄段的参考区间之内，提示该参考区间可以应用于临床实验室。

3 讨论

VB12又被称为氰钴胺，作为辅因子参与甲基化同型半胱氨酸转化为蛋氨酸而影响DNA的合成，参与甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A而影响神经髓鞘的代谢继而影响神经系统的发育与功能[11]。研究表明，VB12与同型半胱氨酸、叶酸是成年人心血管疾病和脑血管疾病的独立危险因子[12-14]。研究还表明，在孩童时期的低维生素B水平和高同型半胱氨酸水平可能对改变其长大后发生慢性疾病的风险具有潜在的影响[15]。因此，正确评估少年儿童时期VB12状态对于健康成长以及预防成年后心脑血管病都具有重要意义。国内外研究均显示，儿童人群中有较高的VB12缺乏率[16-18]。但迄今未有诊断VB12缺乏的金标准，更没有统一可用的健康少年儿童维生素B的参考区间，对VB12缺乏的判定造成了困扰。一方面，除了不同地区人群种族、饮食、生活习惯、性别年龄间可能存在固有的差异外，儿童生长发育动态变化也深深地影响着实验室指标的参考区间[19]，再加上VB12水平测定的仪器和方法眾多，相互间可比性差，很难建立统一的参考范围。另一方面，通常要建立基于大样本的、健康的、儿童人群的参考值调查研究非常困难，在全世界领域都是一项艰巨的任务[10]。因此，国外很多研究也基于医院的“健康人群”建立参考区间[20-21]。在国内尚无多中心大样本自然儿童人群调查研究的情况下，本研究旨在建立基于医院“健康”儿童人群血清VB12水平的参考区间，先行为儿科临床提供可用、有用的参考标准提供循证医学证据，促进临床诊疗的精准化。

建立参考区间的理想做法，应基于健康人群，并对性别、年龄、种族等关键协变量进行分层[22]。因此，本研究将在医院进行健康保健、择期手术的“准健康儿童”作为调查对象，选取经各种实验室检查和体格检查最终结论为“健康”的血清VB12结果纳入统计分析。首先按年龄分层，11岁以内以1岁为一组、11～17岁因样本量小单列为一组，观察男童与女童血清VB12水平的差异，发现所有未成年各年龄组两性间血清VB12水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。与国内重庆（2～7岁）[16]、湖北（健康成人）报道的结果[6]，及多数国外基于青少年人群如美国（3～19岁）[23]、英国（4～18岁）[15]、威尔士（12～13岁）[24]、希腊（6～15岁）[25]、奥地利（2～17岁）[26]等所报道的结果一致；但与国内部分地区成年人群[4]、欧洲10个国家（12.5～17.49岁）[27]、土耳其（7～14岁）[28]、科威特（10～19岁）[29]、中国台湾（12～15岁）[30]、西班牙（13～18.5岁）[31]所报道的男性明显低于女性有所不同。可见，性别对不同地区正常少年儿童血清VB12水平的影响不同，未见有女童血清VB12水平明显低于男童的报道。随后本研究合并两性结果观察各个年龄组间的血清VB12水平。结果发现，2岁以内（含2岁）婴幼儿血清VB12水平最低，依次明显低于>2～5岁和>7～17岁组（P < 0.05）、>5～7岁组（P < 0.05），而这三组又分别明显低于>17岁组（P < 0.05）。总体而言，儿童血清VB12水平有随年龄增加而增加的趋势，与国内外报道的各年龄组间均无统计学差异[4，16，29]，国内[6]与多数国外[15，23，25-29]报道的随年龄有递减趋势结果不同。反映了不同地区儿童年龄对血清VB12水平影响存在较大差异。2岁以下婴幼儿血清VB12水平最低，可能是由于该阶段为儿童体格生长发育最迅速的阶段，对营养的要求相对更高，而此阶段饮食又较为单一，VB12摄入量相对不足从而导致血清VB12水平明显低于2岁以上各阶段的儿童。至于>2～5岁和>7～17岁两个年龄段儿童血清VB12水平无统计学差异且明显低于>5～7岁组的原因有待进一步研究。此外，相关性分析显示，17岁以内未成年人血清VB12水平与年龄存在明显的正相关，也是本研究中血清VB12水平随年龄增长而增加在统计学上的另一种印证。因此，就本次调查的人群而言，儿童血清VB12的参考区间应按3个年龄段进行设置：0～2岁为192.30～338.0 pg/mL，>2～5岁和>7～17岁两个年龄段为192.5～359.5 pg/mL，>5～7岁为194.8～374.9 pg/mL。然后本研究随机选取上述3个年龄区间内正常儿童各20名的血清VB12结果均落在相应参考区间之内，验证了该参考区间的临床适用性。

需要指出的是，本研究所建立的广州地区正常儿童血清VB12水平参考区间是95%的正常儿童血清VB12检测结果会落入的一个范围，其下限和上限并非发生不良临床事件，如VB12缺乏导致的巨幼细胞性贫血或高半胱氨酸血症、神经系统损伤的临界值，有关这些临界值的研究目前也未见有报道，需要在日后进一步行随机对照试验进行研究。

[参考文献]

[1] Kuriyan R，Thankachan P，Selvam S，et al. The effects of regular consumption of a multiple micronutrient fortified milk beverage on the micronutrient status of school children and on their mental and physical performance [J]. Clin Nutr，2016，35（1）：190-198.

[2] Ekabe CJ，Kehbila J，Abanda MH，et al. Vitamin B12 deficiency neuropathy，a rare diagnosis in young adults：a case report [J]. BMC Res Notes，2017，10（1）：72.

[3] Devalia V，Hamilton MS，Molloy AM，et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of cobalamin and folate disorders [J]. Br J Haematol，2014，166（4）：496-513.

[4] 郝玲，田熠華，唐仪，等.我国部分地区成人血浆维生素B12水平比较研究[J].营养学报，2004，26（1）：19-22.

[5] 邓燕，秦雪，黄珊，等.广西防城港地区汉族健康成年男性血清叶酸和维生素B12正常参考值的建立[J].中国临床新医学，2011，4（5）：413-416.

[6] 汪运礼，周宗华，王明仲，等.湖北地区健康成人血清叶酸及维生素B12正常值的研究[J].数理医药学杂志，2000， 13（1）：48-49.

[7] Aparicio-Ugarriza R，Palacios G，Alder M，et al. A review of the cut-off points for the diagnosis of vitamin B12 deficiency in the general population [J]. Clin Chem Lab Med， 2015，53（8）：1149-1159.

[8] Schwettmann L，Berbu S. Reference Interval and Status for Serum Folate and Serum Vitamin B12 in a Norwegian Population [J]. Clin Lab，2015，61（8）：1095-1100.

[9] Kant AK，Graubard BI. Race-ethnic，family income，and education differentials in nutritional and lipid biomarkers in US children and adolescents：NHANES 2003-2006 [J]. Am J Clin Nutr，2012，96（3）：601-612.

[10] CLSI. Defining，Establishing and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory； Approved Guideline. C28-A3 [M]. Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

[11] Miles LM，Allen E，Mills K，et al. Vitamin B-12 status and neurologic function in older people：a cross-sectional analysis of baseline trial data from the Older People and Enhanced Neurological Function（OPEN）study [J]. Am J Clin Nutr，2016，104（3）：790-796.

[12] Stanger O，Herrmann W，Pietrzik K，et al. Clinical use and rational management of homocysteine， folic acid，and B vitamins in cardiovascular and thrombotic diseases [J]. Z Kardiol，2004，93（6）：439-453.

[13] 劉贞.血清同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12水平与冠心病的关系研究[J].中国医药科学，2015，5（21）：159-161.

[14] 曾小容，夏敏，陈平，等.叶酸和维生素B12对脑梗死患者血管内皮功能及神经缺损评分的影响[J].疑难病杂志，2016，15（11）：1104-1107.DOI：10.3969/j.issn.1671-6450.2016.11.002.

[15] Kerr MA，Livingstone B，Bates CJ，et al. Folate，related B vitamins，and homocysteine in childhood and adolescence：potential implications for disease risk in later life [J]. Pediatrics，2009，123（2）：627-635.

[16] 高美哲，黎海芪.重庆地区学龄前儿童血清维生素B12营养状况调查[J].中华儿科杂志，2006，44（1）：7-10.

[17] Thomas D，Chandra J，Sharma S，et al. Determinants of nutritional anemia in adolescents [J]. Indian Pediatr，2015，52（10）：867-869.

[18] De Benoist B. Conclusions of a WHO technical consultation on folate and vitamin B12 deficiencies [J]. Food Nutr Bull，2008，29（2 Suppl）：S238-S244.

[19] Shaw JL，Binesh MT，Colantonio D，et al. Pediatric reference intervals：challenges and recent initiatives [J]. Crit Rev Clin Lab Sci，2013，50（2）：37-50.

[20] Grossi E，Colombo R，Cavuto S，et al. The RELAB project：a new method for the formulation of reference intervals based on current data [J]. Clin Chem，2005，51（7）：1232-1240.

[21] Katayev A，Balciza C，Seccombe DW. Establishing reference intervals for clinical laboratory test results：is there a better way？ [J]. Am J Clin Pathol，2010，133（2）：180-186.

[22] Shaw JL，Binesh MT，Colantonio D，et al. Pediatric reference intervals： challenges and recent initiatives [J]. Crit Rev Clin Lab Sci，2013，50（2）：37-50.

[23] Pfeiffer CM，Caudill SP，Gunter EW，et al. Biochemical indicators of B vitamin status in the US population after folic acid fortification：results from the National Health and Nutrition Examination Survey 1999-2000 [J]. Am J Clin Nutr，2005，82（2）：442-450.

[24] Thomas NE，Cooper SM，Baker JS. Homocyst（e）ine，folate，and vitamin B12 status in a cohort of Welsh young people aged 12-13 years old [J]. Res Sports Med，2008，16（4）：233-243.

[25] Papandreou D，Mavromichalis I，Makedou A，et al. Reference range of total serum homocysteine level and dietary indexes in healthy Greek school children aged 6-15 years [J]. Br J Nutr，2006，96（4）：719-724.

[26] Huemer M，Vonblon K，F■dinger M，et al. Total homocysteine，folate，andcobalamin，and their relation to genetic polymorphisms，lifestyle and bodymass index in healthy children and adolescents [J]. Pediatr Res，2006，60（6）：764-769.

[27] González-Gross M，Benser J，Breidenassel C，et al. gender and age influence blood folate，vitamin B12，vitamin B6，and homocysteine levels in european adolescents the helena study [J]. Nutr Res，2012，32（11）：817-826.

[28] Akin F，Yavuz H，Bodur S，et al. Vitamin B12 levels of subjects aged 0-24 year（s） in Konya，Turkey [J]. J Health Popul Nutr，2014，32（4）：615-622.

[29] Akanji AO，Thalib L，Al-Isa AN. Folate，vitamin B12 and total homocysteine levels in Arab adolescent subjects：reference ranges and potential determinants [J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis，2012，22（10）：900-906.

[30] Shen MH，Chu NF，Wu DM，et al. Plasma homocyst（e）ine，folate and vitamin B（12）levels among school children in Taiwan：The Taipei Children Heart Study [J]. Clin Biochem，2002，35（6）：495-498.

[31] Al-Tahan J，Sola R，Ruiz JR，et al. Methylenetetrahydrofolate reductase 677CT polymorphism and cobalamin，folate，and homocysteine statusin Spanish adolescents[J]. Ann Nutr Metab，2008，52（4）：315-321.

（收稿日期：2017-02-10 本文編辑：程 铭）