江西省2010年-2014年呼吸道感染腺病毒基因特征分析

张艳妮，熊英，龚甜，施勇，徐刚，李建雄，周珺，刘师文，肖芳，刘晓庆

(江西省疾病预防控制中心，江西 南昌330029)

江西省2010年-2014年呼吸道感染腺病毒基因特征分析

张艳妮，熊英，龚甜，施勇，徐刚，李建雄，周珺，刘师文，肖芳，刘晓庆

(江西省疾病预防控制中心，江西 南昌330029)

目的 了解2010年至2014年江西省儿科呼吸道感染患儿中腺病毒的感染状况及其基因特征。方法 2010年至2014年，共采集呼吸道感染患儿的标本2645份，分别进行了7种常见呼吸道病毒的核酸检测，核酸阳性标本进行病毒分离培养获得毒株。设计可以扩增所有腺病毒基因组Hexon基因片段、feiber基因片段的引物，毒株进行扩增，PCR的产物直接进行测序，测序结果与GenBank的已知型别的序列进行比对，确定腺病毒的型别。结果 在2645份呼吸道标本中，核酸检测腺病毒的阳性标本数为259份，阳性率9.79%，对259份核酸阳性标本进行病毒分离，得到46份毒株，病毒分离率为17.76%。46份标本进行PCR、测序、序列比对分析得知：1型ADV为7例，占15.22%，2型ADV为14例，占30.43%，3型ADV为 8例，占17.39%，5型ADV为7例，占15.22%，6型ADV为1例，占2.17%，7型ADV为9例，占19.57%。结论 2010年至2014年，南昌地区的腺病毒感染以2型、3型、7型为主，1型、5型、6型比较少见，暂时未发现新的型别引起的感染。

呼吸道感染；腺病毒；基因特征

腺病毒是一种呼吸道感染的常见病原体，是在1953年由小儿扁桃体中首次分离得到，可引发急性、慢性潜在感染，能够引起局部流行和爆发流行。腺病毒是普通的机会性病原体，可感染各年龄人群，并稳定传播[1，2]。目前为止，已经发现的腺病毒有51种血清型，分为A-G 6个亚属；B属可以引起严重的呼吸道疾病，C属、E属也可引起呼吸道疾病。20世纪50-60年代，腺病毒引起的儿童肺炎的发病率和死亡率均较高；到了80年代以后有所下降[3]，但是近些年腺病毒引起的感染又有所升高，且在近年国内外发生的多起因腺病毒爆发而引起的呼吸道传染病疫情中发现了多种新型别的腺病毒如HAdV-55、HAdV-53、HAdV-65[4-6]。人类腺病毒是无包膜双链DNA病毒，基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1～E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的 L1～L5基因[1，7]。 Hexon基因位于晚期转录基因L3上，hexon蛋白携带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇；Fiber基因位于晚期转录基因L5上，Fiber蛋白有血清特异性，含种特异性抗原决定位点；Hexon基因和Fiber基因是新型腺病毒重组发生的多发区域，可利用Hexon基因高度可变区域的扩增进行型别的鉴定[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本及毒株来源2010年5月-2014年12月，在江西省儿童医院共收集到2645份发热呼吸道患儿标本 （其中在门诊患儿中采集的咽拭子标本1707份，痰标本117份，住院患儿采集的支气管肺泡灌洗液标本821份）。收集到的所有标本都进行了7种常见的呼吸道病毒流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒的核酸检测。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取取采集的患儿标本（咽拭子、痰、支气管肺泡灌洗液）200μl，采用 Qiagen 公司的病毒核酸提取试剂盒提取病毒DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。病毒培养物DNA的提取相同。

1.2.2 PCR检测采用腺病毒的通用引物VA3、VA6对提取的标本的DNA进行检测。引物序列及PCR 程序均参考文献[8]。 VA3：5’-TCTCGGTVAGRCGYGCGCARTC-3’，VA6：5’-TCTCGCAGCAC NGGATGCATCT-3’，目标片段位于L3基因内且长度约为 500bp。 PCR 程序 94℃ 5min，94℃ 1min，54℃ 45s，72℃ 2min，35 个循环，72℃ 5min。 扩增的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，目的片段的大小约为500bp。

1.2.3 病毒分离及鉴定对经过核酸检测腺病毒阳性的标本，接种于覆盖率80%左右的Hep-2细胞上，每日观察细胞病变，对细胞出现变圆、聚集成类似于葡萄串样的疑似腺病毒引起的病变，对疑似病变的标本进行收集保存。共对260份腺病毒阳性的标本进行了病毒分离培养，共得到46份疑似腺病毒毒株。对这46份标本再次用腺病毒通用引物进行鉴定，核酸提取、PCR扩增及电泳均同前。电泳结果显示，这46份标本均在目的片段约500bp有明显条带，说明这46份毒株均为腺病毒的毒株。

1.2.4 腺病毒序列测定序列测定的引物参考文献[9]，由上海生工生物工程公司合成。采用巢式PCR扩增Hexon基因的HVR1-HVR6基因片段，二次扩增产物大小约为688～820bp。

一次扩增体系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物 各 0.8μl，H2O：12.4μl，DNA：6μl，扩 增 程 序 ：94℃ 、2min，94℃ 、1min，45℃ 、1min，72℃ 、2min，40个循环，72℃、5min。 二次扩增体系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物各 0.8μl，H2O 15.4μl，DNA 3μl，扩增程序同前。

扩增B属、C属fiber基因的部分基因片段，引物序列参考文献[10，11]见表 1。

表1 扩增B属、C属fiber基因的部分基因片段，引物序列参考文献

扩增体系：Green Master Mix(2x)：10μl，引物各0.8μl，H2O：12.4μl，DNA：6μl，扩 增 程 序 ：94℃ 、5min，94℃、1min，54℃、45s，72℃、2min，40 个循环，72℃、5min。扩增产物直接送上海生工测序。

1.3 序列比对将测序得到的46份毒株序列与GeneBank上已经公布的序列进行BLAST比对分析。用DNA STAR和MEGA 5.0软件对序列进行核苷酸同源性分析和基因亲缘性关系的分析。

腺病毒的hexon基因各个型别参考序列均从GenBank下载，各序列登录号为：ADV3/DQ115429、ADV7/DQ115455、ADV1/DQ115407、ADV2/DQ1154 18、ADV5/DQ115451、ADV6/DQ115454。 见图 1。

腺病毒的fiber基因各个型别参考序列均从GenBank下载，各序列登录号为：ADV3/AY224416-1、ADV7/AY921616、ADV1/AC000017.1、ADV2/A C000007.1、ADV5/AC000008.1、ADV6/AB125751.1。见图2。

2 结果

图1 江西省腺病毒Hexon基因序列与各型别Hexon基因参考序列进化树。

图2 江西省腺病毒Fiber基因序列与各型别Fiber基因参考序列进化树。

2.1 病毒分离在2645份呼吸道标本中，核酸检测腺病毒的阳性标本数为259份，阳性率9.79%，对259份核酸阳性标本进行病毒分离，得到46份毒株，病毒分离率为17.76%。其中2013年、2014年未分离到腺病毒毒株其他年份均分离到腺病毒毒株。具体数据见表2。

表2 2010-2014各年份采集的标本数及核酸检测、病毒分离数据

2.2 PCR检测对病毒分离得到的46份毒株用腺病毒通用引物VA3、VA6二次进行PCR测定，对再次鉴定为腺病毒阳性的标本用测序引物进行扩增，扩增产物送上海生工进行测序，测序结果到GeneBank进行BLAST比对分析得知：1型ADV为7例，占15.22%，2型ADV为14例，占30.43%，3型ADV为8例，占17.39%，5型ADV为7例，占15，22%，6型 ADV 为 1例，占 2.17%，7型 ADV 为9例，占19.57%。具体数据见表3。

由表3可以明显的看出，2010年ADV2型占到了45.45%，为明显的优势流行型别；ADV5、ADV3所占的比例一样多，也是当年的流行基因型别，但不处于优势地位。2011年ADV2所占的比例明显的降低ADV7、ADV1所占的比例明显上升，2011年有多个基因型别共同流行，还检测到了一株ADV6。2012年ADV7为优势流行株。

2.3 序列测定腺病毒的hexon蛋白携带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇，hexon蛋白具有7个高度可变区域，这些区域与腺病毒的型别特异性密切相关。通过对hexon基因高度可变区域进行测序并与NCBI上已有的各个型别的序列进行比对得知，46株毒株共有 6个基因型别 HADV1、HADV2、HADV5、HADV6、HADV3、HADV7。 每 个型别的毒株之间的同源性分别为HADV1：98.5%～100% 、HADV2：99.0% ～100% 、HADV5：95.4% ～100% 、HADV3：99.8% ～100% 、HADV7：99.8% ～100%；毒株与参考株之间的同源性为HADV1：98.5% ～100% 、HADV2：99.7% ～99.8% 、HADV5：95.4% ～100% 、HADV6：98.8% 、HADV3：98.9% ～99.1%、HADV7：95.8%～95.9%。

表3 2010-2014各年腺病毒基因型别

根据Hexon比对的分析的结果，分别针对6种型别的fiber基因设计了引物，序列测定并与NCBI上已有的腺病毒序列进行比对分析，最终分析的结果和Hexon基因的型别的判定完全相符合。每个型别的毒株之间的同源性分别为HADV1：98.1% ～100% 、HADV2：98.1% ～100% 、HADV5：98.5% ～100% 、HADV3：96.8% ～100% 、HADV7：98.4%～100%；毒株与参考株之间的同源性为HADV1：97.9% ～99.6% 、HADV2：98.1% ～99.1% 、HADV5：98.8% ～99.7% 、HADV6：97.6% 、HADV3：98.4%～100%、HADV7：98.4%～99.8%。

3 讨论

本研究通过对2010年至1014年江西省儿童医院就诊的呼吸道患儿的标本进行PCR检测及型别的测定，结果表明南昌地区的ADV阳性率为9.83%，明显低于南京地区2010年至2011年26.55%的检出率[12]，且优势流行株为2型（14/46），与南京地区报道的3型流行株有一定的差异，与北京报道的3型流行为主也存在差异。腺病毒引起的呼吸系统感染多发生在冬、春两季，且婴幼儿较易感染[13，15]。 有报道显示，HADV-2属于C属腺病毒，主要引起儿童的呼吸道疾病，引起的临床症状较轻。B属的HADV-3和HADV-7是婴幼儿呼吸道腺病毒感染的常见血清型，能够引起腺病毒的爆发感染，病死率高达12%[16]。与人腺病毒相关的呼吸道感染很常见，多感染5岁以下儿童，尤其2岁以下儿童发病率最高[17]。国外的研究发现，HADV导致的呼吸道感染的检出率约在8.9%-10.5%，本研究的结果显示，江西省连续5年监测人腺病毒，检出率分别为8.29%（50/603），10.53%（84/798），3.84%（20/521），12.57%（66/525），19.70%（39/198），这于北京地区2003-2008检出率（1.69%）相比较，平均高出了6倍左右[18]。

本研究中分离到的46个毒株，分属于6个不同的血清型，且都属于B属和C属常见的的亚型。目前已经发现的腺病毒的基因重组主要集中在Hexon基因和Fiber基因，本研究对这两个基因进序列进行扩增，以便对型别做出判断；通过对46份毒株的两个基因片段测序分析，两个片段比对确定的基因型别完全相同，则可以排除基因之间存在存在重组的可能，在连续5年的监测中，并未发现新型的腺病毒及腺病毒基因的重组。2010年、2011年引起的呼吸道感染的腺病毒主要以ADV2型为主，2012年以ADV7型腺病毒为主。因为2013年、2014年未分离到腺病毒的毒株，无从判断2013年、2014年流行的腺病毒型别，无法判断优势基因型。在今后的腺病毒监测过程中，应该对不同时期流行的腺病毒的Hexon基因、Fiber基因以及基因间的重组变异情况进行实时的监测，对腺病毒的流行特征进行更全面的认识，为预测人腺病毒可能引起的暴发与流行性疾病提供更加详细可靠的参考依据。

[1]陈娜娜，向冬喜，郑丛龙.腺病毒及其研究进展[J].大连医科大学学报，2010，32(5)：586-590.

[2]Walls T，Shankar AG，Shingadia D.Adenovirus：an increasingly important pathogen in paediatric bone m arrow transplant patients[J].Lancet Infect Dis，2003，3：79-86.

[3]唐浏英，徐文波.腺病毒分子流行病学研究[J].中华流行病学杂志.2008，29(8)：836-839.

[4]Matsushima Y，Shimizu H.Novel Human Adenovirus Strain，Banglasesh[J].Emerging Infectious Diseases，2012，18(5)：846-848

[5]Walsh MP，Chintakuntlawar A，Robinson CM.Evidence of Molecular Evolution Driven by Recombination Events Influencing Tropism in a Novel Human Adenovirus that Causes Epidemic Keratoconjunctivitis[J].PLoSONE，2009，4(6)：1-12.

[6]Walsh MP，Seto J，Jones M，et al.Computational Analysis Identifies Human Adenovirus Type 55 as a Re-Emergent Acute Respiratory Pathogen[J].JClin Microbiol，2010，48(3)：991-993.

[7]黄国虹，许文波.腺病毒新型别的研究进展[J].病毒学报，2013，29(3)：342-348.

[8]许文波，崔爱利，张勇，朱贞，唐浏英，等.江苏省不明原因轻型呼吸道传染病暴发的病因学研究[J].病毒学报，2005，21(5)：325-330.

[9]Lu XD，Erdman D.Molecular typing of human adenoviruses by PCR and sequencing of a partial region of the hexon gene[J].Arch Virol，2006，151：1587-1602.

[10]唐浏英，张丽丽，朱贞，徐文波.7株B亚属人腺病毒纤维基因特征分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2009，29(1)：62-64.

[11]Adhikary AK，Inada T，Banik U，et al.Identification of Subgenus C Adenoviruses by Fiber-Based Multiplex PCR[J].Clin Microbiol，2004，42(2)：670.

[12]高小倩，金玉，谢志萍，高寒春，谢乐云，张健，段招军.南京地区2010-2011年度呼吸道感染患儿腺病毒的流行病学研究 [J].病毒学报，2012，28(5)：531-534.

[13]邓洁，钱渊，赵林清，朱汝南，王芳，孙宇.北京地区2006年流行的3、7和11型腺病毒部分六邻体基因序列分析 [J].中华流行病学杂志，29(10)：1024-1028.

[14]杨占秋，余宏.临床病毒学[M].2000：204-210.

[15]刘滕颖子，吕星，黄达娜，等.2011－2012年深圳市呼吸道腺病毒分子分型及其流行特征[J].热带医学杂志，2014，14(1)：12-15.

[16]高文娟.人腺病毒南京、湖南、兰州地方株型别鉴定及Hexon全基因序列进化分析[D].兰州：兰州大学，2013.

[17]Pacini DL，Collier AM，Henderson FW.Adenovirus infections and respiratory illnesses in children in group day car[J].J Infect Dis，1987，156：p920-927.

[18]邓洁，钱冤，赵林清，等.近年北京儿科急性呼吸道感染患儿中腺病毒的型别监测[J].中华儿科杂志，2010，48(10)：739-743.

M olecular epidem iology analysis of Humen Adenovirus in Jiangxi Province from 2010 to 2014

ZHANG Yanni，XIONG Ying，GONG Tian，SHIYong，XU Gang，LIJianxiong，ZHOU Jun，LIU Shiwen，XIAO Fang，LIU Xiaoqing.
Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective To investigate the status and genetic characteristics of adenovirus infection in children with respiratory tract infection in Jiangxi province from 2010 to 2014.M ethods A total of 2，645 samples of respiratory tract infection were collected from 2010 to 2014，the nucleic acid of seven common respiratory virus types were detected.Virus positive specimens were isolated and cultivated to obtain strains.The primers of adenovirus genome Hexon and feiber gene fragmentwere designed to amplify strain.The type of virus was determined by directly sequencing PCR products，and obtained sequences were compared with the known genotypes in GenBank.Results Among 2，645 respiratory specimens，there were 259 positive samples of adenovirus and its positive rate was 9.79%.Forty-six strains were obtained from isolation of 259 nucleic acid positive specimens，with virus isolation rate as 17.76%.The sequence comparative analysis of PCR，sequencing of 46 samples showed：7 cases of HADV1(15.22%)，14 cases of HADV2(30.43%)，8 cases of HADV3(17.39%)，7 cases of HADV5(15.22%)，1 case of HADV6(2.17%)，9 cases of HADV7(19.57%).Conclusion The prevalence of adenovirus infection in Nanchang area wasmainly featured by type II，III and VII，with rare type I，V and VI，and no new type was discovered to lead to infection from 2010 to 2014.，

Respiratory tract infection；Humen adenovirus；Molecular epidemiology

R446.62，R511.8

A

1674-1129(2017)05-0650-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.005

江西省卫计委课题，项目编号：20156032

张艳妮，女，1983年生，硕士，主管技师，主要从事分子病毒的检测工作。E-mail：zhang-yn99@hotmail.com

2017-03-16；

2017-06-10)