缺血性中风病患者体质、证候与MMP9，IL6，MTHFR基因多态性的相关性研究

孙帅玲++谢雁鸣++张寅 王志飞 杨靖 王丹巧 焦玥 陈军 陶艳会

[摘要]通過研究缺血性中风病患者证候、体质与MMP9，IL6，MTHFR基因多态性之间相互关系，对缺血性中风病患者从体质、证候与MMP9，IL6，MTHFR基因多态性关系进行分析。采集缺血性中风病患者的相关资料，建立数据库，进行统计分析。结果纳入的61例缺血性中风病患者中风痰瘀阻证患者出现频率最高，共30例；痰湿质是缺血性中风病患者易发体质，共20例；体质与证候对应关系分析显示：气虚体质患者发病后倾向表现为气虚血瘀证；痰湿体质和平和体质患者发病后倾向表现为风痰瘀阻证；证候与MMP9，IL6关系：风痰瘀阻证、气虚血瘀证患者MMP9，IL6分布经Z检验有显著统计学差异（P<005），气虚血瘀证患者MMP9水平明显高于风痰瘀阻证患者；风痰瘀阻证患者IL6水平明显高于气虚血瘀证患者；证候、体质与MTHFR基因多态性关系：61个样本中，共检测到杂合突变34例；纯和突变15例；无突变12例，该基因位点突变率是未突变患者的408倍；痰湿质患者发病后其MTHFR C677T基因型倾向于表现为CT基因型；风痰瘀阻证患者发病后易表现为TT基因型；阴虚动风证患者发病后易发生杂和突变，表现为CT基因型。从缺血性中风病患者证候与体质关系分析显示，痰湿质、平和质患者发病后易表现为风痰瘀阻证；气虚质患者发病后易表现为气虚血瘀证。提示发病前如对于偏颇体质进行调理，或许对预防缺血性中风病有一定效果；从缺血性中风病患者证候与MMP9，IL6关系分析显示，风痰瘀阻证与IL6水平具有相关性，气虚血瘀证与MMP9水平具有相关性。从缺血性中风病患者证候与MTHFR基因多态性关系分析显示，TT基因型患者发病后易表现为风痰瘀阻证，CT基因型患者发病后易表现为阴虚动风证；从缺血性中风病患者体质与MTHFR基因多态性关系分析显示，CT基因型患者易表现为痰湿质。为更深入地认识缺血性中风病病机提供依据，为临床治疗与预防提供干预策略。

[关键词]缺血性中风病； 体质； 证候； MMP9，IL6，MTHFR基因多态性

Study on relationship between constitution and syndrome of MMP9，

IL6 and MTHFR gene in patients with ischemic stroke

SUN Shuailing1， XIE Yanming1， ZHANG Yin1， WANG Zhifei1， YANG Jing1*， WANG Danqiao2，

JIAO Yue2， CHEN Jun3， TAO Yanhui3

（1. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chineses Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. Medical Experiment Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. Wuhan Branch， Beijing Liuhe Large Gene Technology Co.， Ltd.， Wuhan 430000， China）

[Abstract]By studying the relationship between syndromes， physique and MMP9， IL6 and MTHFR gene polymorphisms in patients with ischemic stroke，The relationship between MMP9， IL6 and MTHFR gene polymorphism was analyzed in patients with ischemic strokeThe data were collected by collecting the data of patients with ischemic stroke， and the statistical analysis was carried out Syndrome：61 cases of ischemic stroke patients with stroke phlegm stasis syndrome in patients with the highest frequency， a total of 30 cases； Physical constitution： phlegm is ischemic stroke patients prone to physical， a total of 20 cases； The analysis of the relationship between constitution and syndrome shows that the patients with qi deficiency constitution tend to show qi deficiency and blood stasis syndrome after onset， The analysis of the relationship between constitution and syndrome shows that the patients with qi deficiency constitution tend to show qi deficiency and blood stasis syndrome after onset， Phlegm constitution and physical condition after the onset of symptoms tend to wind phlegm stasis syndrome； Syndrome and MMP9， IL6 relationship：The distribution of MMP9 and IL6 in patients with qi and phlegm stasis syndrome and qi deficiency and blood stasis syndrome was significantly different from that in Z test （P<005）. The level of MMP9 in patients with qi deficiency and blood stasis syndrome was significantly higher than that in patients with wind phlegm and blood stasis syndrome；The level of IL6 in patients with phlegm and blood stasis syndrome was significantly higher than that in patients with qi deficiency and blood stasis syndrome Syndrome， constitution and MTHFR gene polymorphism： among the 61 samples， 34 were heterozygous mutations， 15 were pure and mutated， 12 had no mutation， The mutation rate of this locus was 408 times that of patients without mutationsThe genotype of MTHFR C677T in patients with phlegm dampness tends to be CT genotype Wind phlegm stasis syndrome in patients with easy to appear after the TT genotype； Yin deficiency syndrome in patients prone to miscellaneous and mutations， the performance of CT genotype； Analysis of the relationship between syndromes and physique in patients with ischemic stroke，Phlegm and dampness， flat quality patients after the onset of easy to show the wind phlegm stasis syndrome； Qi deficiency after the onset of symptoms in patients with Qi and blood stasis Suggesting that before the onset of such as for the partial physical conditioning， may be on the prevention of ischemic stroke have a certain effect； Analysis of the relationship between syndromes and MMP9 and IL6 in patients with ischemic stroke， Wind phlegm stasis syndrome and IL6 levels are related， Qi deficiency and blood stasis syndrome and MMP9 levels are related Analysis of the relationship between syndromes and MTHFR gene polymorphism in patients with ischemic stroke， TT genotype after the onset of symptoms prone to wind phlegm stasis syndrome， CT genotype patients after the onset of easy manifestations of Yin deficiency wind syndrome； Analysis of the relationship between physique and MTHFR gene polymorphism in patients with ischemic stroke， CT genotype is easy to show phlegmFor more indepth understanding of pathogenesis of ischemic stroke to provide the basis， For the clinical treatment and prevention to provide intervention strategies.endprint

[Key words]ischemic stroke； physical； syndrome； MMP9， IL6， MTHFR gene polymorphism

缺血性中风病是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化，近年来缺血性中风病发病率、死亡率逐年升高，全球疾病负担研究报告指出，自2010年来缺血性中风病成为导致中国居民死亡主要原因。西医微观学即基因、蛋白层面对该病的研究成为目前的热点，基因翻译蛋白；中医对于缺血性中风病认识多从宏观角度即证候与体质层面，体质是证候内在基础，体质学说与基因组学都具有遗传本质，都受先天因素与后天环境影响产生改变，这些相似性决定了他们之间具有关联，基因与蛋白之间、证候与体质之间又有一定联系，因此，从体质、证候、基因、蛋白层面对该病进行研究，深入了解其发病机制，为临床治疗与预防提供一定参考作用。

1资料

11研究对象

2016年11月1日—2017年1月10日期间分布在全国7家临床单位（北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京天坛医院、河南中医学院第一附属医院、河南中医学院第一附属医院豫东医院、广州中医药大学第二附属医院、长春中医药大学附属医院、太原市中医院）缺血性中风病患者61例。

12诊断标准

西医诊断标准：依据中华医学会神经病学分会脑血管病学组2014年发布的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[1]。中医诊断标准：参照1996年国家中医药管理局全国中医脑病急症科研协作组制定的《中风病诊断与疗效评定标准（试行）》[2]。

13纳入、排除及剔除标准

纳入标准：①病史及CT/MRI等检查符合TOAST分型属大动脉粥样硬化性脑梗死；②首次发病患者≥50%；③初发患者2周以内；④年龄35～80岁；⑤本人或法定监护人签署知情同意书。排除标准：①西医诊断为TIA、出血性脑卒中及混合型脑卒中；②TOAST分型标准为心源性栓塞型、其他明确病因型缺血性脑卒中；③西医诊断为脑梗死但意识不清。剔除标准：①不符合纳入标准而被误纳入者；②纳入后无任何数据者。

14中医证候

依据1996年国家中医药管理局全国中医脑病急症科研协作组制定的《中风病诊断与疗效评定标准（试行）》中医证型、中医症状体征。

15中医体质

依据中华中医药学会2009年发布的《中医体质分类与判定》[3]标准的中医体质分型。

2方法

21生物样本采集

符合入组条件的所有研究对象抽血前1天清淡饮食，晚饭后禁食8～12 h，第2天空腹抽取外周静脉血，用于蛋白检测的静脉血离心后分装在EP管，-80 ℃冰箱保存；用于基因多态性分析的静脉血置于 EDTA 抗凝管中，-80 ℃冰箱保存。

22MMP9检测

221材料

Elisa试剂盒（R&D公司），批号（lot）P118203；美国Bioteck Eon全自动酶标仪。

222酶联免疫吸附法

试剂盒4 ℃保存，使用前恢复至室温。待测样品-80 ℃保存，使用前融化至室温，充分混匀后使用。溶液配制：用超纯水按照1∶25进行稀释。对照品配制：用超纯水溶解Humman MMP9标准品，得质量浓度为20 μg·L-1的储备液。混匀，15 min后使用。每管加入500 μL Calibrator Diluent RD510后，对储备液依次进行对倍稀释。得到标准曲线质量浓度为20，10，5，25，125，0625，0313 μg·L-1。只含有Calibrator Diluent RD510作为0 μg·L-1。

223Substrate solution配制

显色剂A和显色剂B等体积混合后避光保存。使用前15 min内配制。样品稀释：按照预实验结果稀释所有样品（取10 μL样品加入490 μL的Calibrator Diluent RD510进行稀释）。加样：取出事先准备好的酶标板，固定于板架上，每加入100 μL Assay Diluent RD134，然后每孔分别加入不同质量浓度的对照品和样本各100 μL，盖上封板膜，室温下，振动孵育 2 h。洗板：甩掉酶标板内液体，用事先准备好的洗液重复洗板4次，400 μL/孔。最后一次冲洗后在实验台上铺几层吸水纸，酶标板朝下拍干孔内残余的液体。每孔加入Humam MMP9 Conjugate 200 μL，盖上封板膜，在室温下振动孵育 1 h；再次洗板；每孔加入Substrate Solution 200 μL，室温下避光静置30 min。每孔加Stop solution 50 μL，终止反应（颜色由淡蓝色转为黄色）。测定：在终止反应后30 min内用酶标仪在450 nm波长处读取各孔的吸光度A，在540 nm波长处读取各孔的A作为校正值。相减后得到校正后的A。计算：根据对照品浓度及A，绘制标准曲线，根据标准曲线计算每个样本的浓度。以对照品A对数为横坐标，质量浓度对数为纵坐标，绘出标准曲线，确定回归方程Y=7076 98/[1+（X/91603 35）×（-0879 36）]+0033 26，R2=0997 8。

23IL6检测

231材料

Elisa试剂盒（R&D公司），批号（lot）P123142；美国Bioteck Eon全自动酶标仪。

232溶液配制

试剂盒4 ℃保存，使用前恢复至室温。待测样品-80 ℃保存，使用前融化至室温，充分混匀后使用。洗液：用超純水按照1∶10进行稀释。对照品配制：用超纯水溶解Humman IL6标准品，得到质量浓度为20 μg·L-1的储备液。混匀，15 min后使用。每管加入500 μL Calibrator Diluent RD175后，对储备液依次进行稀释。得到标准曲线质量浓度为10，5，125，0625，0313，0156 μg·L-1，只含有Calibrator Diluent RD175作为0 μg·L-1。endprint

233酶联免疫吸附法

Substrate solution配制：显色剂A和显色剂B等体积混合后避光保存。使用前15 min内配制。样品稀释：按照预实验结果稀释所有样品（取10 μL样品加入490 μL的Calibrator Diluent RD175进行稀释）。加样：取出事先准备好的酶标板，固定于板架上，每加入100 μL Assay Diluent RD134，然后每孔分别加入不同浓度的对照品和样品各100 μL，盖上封板膜，室温下，振动孵育 2 h。洗板：甩掉酶标板内液体，用事先准备好的洗液重复洗板6次，400 μL/孔。最后一次冲洗后在实验台上铺几层吸水纸，酶标板朝下拍干孔内残余的液体。每孔加入Humam IL6 Conjugate 200 μL，盖上封板膜，在室温下振动孵育2 h；再次洗板；每孔加入Substrate Solution 200 μL，室温下避光静置60 min。每孔加入Amliter Solution 200 μL，室温下避光静置30 min。每孔加Stop solution 50 μL，终止反应（颜色由淡蓝色转为黄色）。测定：在终止反应后30 min内用酶标仪在450 nm波长处读取各孔的吸光度A，在640 nm波长处读取各孔的A作为校正值。相减后得到校正后的A。计算：根据对照品浓度及A，绘制标准曲线，根据标准曲线计算每个样本的浓度。以对照品A对数为横坐标，质量浓度对数为纵坐标，绘出标准曲线，确定直线回归方程Y=0067X+0148 9，R2=0999 8。

24基因检测

241全血DNA提取

采用QIAamp DNA Micro kit提取全血DNA提取。实验通过ATL、蛋白酶K和AL在56 ℃下使细胞裂解，释放出核内的DNA，再通过柱纯化技术回收释放的DNA。取200 μL全血（不要取血块）转至一新的15 mL离心管中。加入300 μL的ATL buffer。加入20 μL蛋白酶K。加入300 μL的AL buffer，在Vortex上振荡15 s，确保Mix充分混匀。56 ℃恒温孵育30 min （若用Thermomixer，需要mix，若用水浴锅孵育则需要每5 min左右手动摇匀1次） 。孵育后取出样品，待降到室温后加入200 μL的无水乙醇（4 ℃或-20 ℃冰冻），Vortex 15 s，室温静置3 min。

242DNA纯度检测

吸取DNA溶液2 μL，在紫外线分光光度仪上测定样品在230，260，280 nm波长处的吸光度A；DNA纯度=A260/A280。纯度均达标A260/A280﹥18，A260/A230>20。

243DNA检测方法

2431仪器與试剂5417R低温台式离心机（Eppendorf），PTC200 PCR仪（BIORAD），DYY8C电泳仪（北京六一仪器厂），UVIV紫外分析仪（北京市新技术应用研究所），ABI 3730XL型DNA测序仪（Applied Biosystems），Ex Taq DNA聚合酶（Takara）。

2432引物设计根据NCBI网站上提供的标准参考序列，针对MTHFR C677T的位点rs1801133软件Primer Premier 50进行引物设计。（S03210620F）rs1801133F：TGTGGGAGTTTGGAGCA，（S03210620R）rs1801133R：CTGATTTAAGCAGGATTTGT，743 bp；测序引物（S03210620F）rs1801133F1：CATCCCTCGCCTTGAACAG。

2433PCR扩增条件按照2432确定的引物进行PCR扩增，反应体系见表1。

2434PCR产物纯化按照Millipore公司96纯化板操作流程操作：向96纯化板孔中加入100 μL ddH2O，取出PCR产物至96纯化板中室温静置10 min，真空抽滤泵抽 10 min至抽干，向96孔纯化板中加入40 μL ddH2O，室温溶解10 min，取出对应的孔中的纯化产物至另一96孔PCR板中。

2435PCR产物序列测序测序反应体系为2 μL Mix（Bigdye31，5× sequencing buffer，H2O），2 μL纯化后的PCR产物，1 μL引物（5 mmol·L-1）。测序反应程序为95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 90 s，35个循环；终止反应。PCR产物在北京六合华大基因科技有限公司应用Sanger测序法对扩增产物进行直接测序，应用Sequence Scanner软件将测序结果与标准序列进行比对找出突变位点。

25资料处理与统计方法

251资料处理

采用双人双录方法将CRF独立录入Epidata软件，对一录和二录数据进行“差异性校验”，如果前后2次录入的数据有不一致之处，认真核实纸质CRF或其他原始记录后一一修改数据，直至前后2次录入的数据完全一致。

252统计方法

本研究选择SPSS 210统计软件分析数据。所有的统计分析检验均采用双侧假设检验，假设检验水准均取α=005，即P≤005将被认为所作检验的差别有统计意义。数据统计描述与推断的描述指标和假设检验的原则如下：HardyWeinberg平衡定律检验入组患者遗传是否平衡；计量资料进行正态性检测，正态分布资料采用两独立样本t检验，结果用±s表示；两组间非正态资料采用MannWhitney U检验，3组间偏态资料行KruskalWallis H检验；运用卡方检验处理计数资料；两变量之间相关性采用对应分析，四变量之间相关性采用多重对应分析。Logistic回归模型分析痰湿质与非痰湿质、大动脉型与小动脉型患者发病危险因素。endprint

26技术路线图

本研究对7家临床单位纳入的61例缺血性中风病患者进行资料、生物样本采集，应用统计学分析方法探究缺血性中风病患者中醫体质、中医证候、炎症相关蛋白（MMP9，IL6），MTHFR基因多态性特点，同时对其之间的相关性进行分析。研究技术路线见图1。

3结果

31人口学资料分析

总病例61例，患者平均年龄为（6413±753）岁，最大年龄80岁，最小年龄47岁；其中男性患者45例，女性患者16例；既往患有高血压41例；患有糖尿病患者18例；患有高血脂患者15例。

32中医体质分析分布情况

61例急性缺血性中风病患者中，最常见中医体质类型是痰湿质20例（33%），其余依次为血瘀质11例（18%）、平和质8例（18%）、气虚质8例（13%）、阴虚质4例（7%）、阳虚质4例（7%）等，见表2。

33中医证候分布情况

61例急性缺血性中风病患者中，最常见证型是风痰瘀阻证30例（49%），其余依次为气虚血瘀证11例（18%）、风火上扰证7例（12%）、阴虚风动证5例（8%）、风痰火亢证3例（5%）等，见表2。

34证候与体质的相关性分析

对应分析法是由定性变量构成的交互汇总表来揭示变量间的联系的1种统计学方法，采用这个方法来初步探索缺血性中风病患者证候分型与体质分类之间互相分布中的关系。气虚体质患者发病后容易表现为气虚血瘀证；痰湿质、平和质患者发病后易表现为风痰瘀阻证，见图2。

35蛋白、基因检测

351风痰瘀阻证、气虚血瘀证患者MMP9，IL6分布及其相关性比较

MMP9水平气虚血瘀证患者（26386±117567）明显高于风痰瘀阻证患者（25719±167962），经Z检验有显著统计学差异（P<005）；IL6水平风痰瘀阻证患者（635±14734）明显高于气虚血瘀证患者（344±2246），经Z检验有显著统计学差异（P<005）。

352MTHFR C677T基因多态分析

3521MTHFR C677T基因多态性检测应用Sanger测序方法对例61例缺血性中风病患者MTHFR C677T（位点rs1801133）进行检测，检测结果显示：61个样本中，共检测到杂合突变34例；纯和突变15例；无突变12例，该基因位点突变率是未突变患者的408倍，见图3～5。

3522男女患者基因型、等位基因HW遗传平衡检测男女患者基因型、等位基因检测符合HW遗传平衡，各组具有群体代表性，见表3。

3523体质、证候与MTHFR基因型关系分析CT基因型患者发病后易表现为痰湿质，见图6。风痰瘀阻证患者发病后其MTHFR C677T基因型易表现为TT基因型；阴虚动风证患者发病后其MTHFRC677T基因型易表现为CT基因型，见图7。

36体质、证候、基因、炎症相关蛋白四者之间关系

应用多重对应分析对体质、证候、验证相关蛋白、基因四者之间对应关系进行分析，因对应分析中的变量均为计数资料，MMP9，IL6为计量资料，根据其参考值范围，将参考值范围及小于参考值范围的值设置为1，大于参考值范围的值设置为2，由于MMP9水平均参考值范围及小于参考值范围，故不纳入分析，各变量在2个维度上的区分程度，体质、证候这2个变量在2个维度上的区分程度较好，MTHFR基因在第2维度上区分程度较好，IL6在两维度上的区分程度均较差，见图8。痰湿质与风痰瘀阻证之间有联系，气虚质与气虚血瘀证有联系，见图9。

4讨论

41缺血性中风病患者证候与体质的关系

411风痰瘀阻证是缺血性中风病患者主要证候

对于缺血性中风病成因，历代医家言论各有偏重。现代对其病因学的认识已基本一致，认为缺血性中风是在气血亏虚的基础上，遇有劳倦内伤、忧思恼怒、嗜食肥甘厚味、烟酒等诱因，日久可致脏腑阴阳失调，气血逆乱，上冲犯脑，发为中风，临床以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、语言謇涩或失语为主症的常见疾病[4]，多发于中、老年人。20世纪80年代，王永炎院士提出中风病证候急症以风痰瘀血、痹阻络脉、风痰上扰、痰热腑实多见，恢复期以气虚血瘀为主。痰、瘀是中风的病理基础和主要治病因素，在病理上密切相关，两者皆以虚为基础，因虚生痰，因虚生瘀，痰瘀互生，痰和瘀往往相互胶着，而脂质代谢与中医的“痰瘀”密切关系。痰瘀互结，蕴结于脑，毒邪内生，损伤脑络是缺血性中风病的主要病理机制。对缺血性中风病患者证型分布规律，杨牧祥等[5]研究显示以气虚、血瘀、痰阻为主；杨利等[6]对中风病患者痰瘀证候分布和演变规律分析显示，血瘀证和痰证贯穿于中风病各个时期，且所占比例较高；中风病恢复期患者以血瘀证、痰证常见。这一证候分布和演变规律提示，瘀血和痰浊在中风病发病中占有重要地位，且贯穿于缺血性中风病始终。因此，痰、瘀因素不容小觑。

412痰湿质是缺血性中风病患者主要体质类型

古代，中医就有“肥人多痰湿，肥人多中风”之说，当代医家将缺血性中风病病理因素归纳为虚、火、风、痰、气、血，个体到底是因何发病，则与患者个人体质有密切的关系，但痰浊始终是最主要的病理因素。痰湿质的患者多体胖少动，日久脉道涩而不利，痰湿质之人，多嗜食肥甘或脾气亏虚，脾失健运，气滞痰阻，一旦邪气相干，或动其伏痰，或邪随痰化，痰气交阻，进一步涩滞脉道，阻其血气而成瘀，“贼邪不泻，或左或右，邪气反缓，正气即急，正气引邪，唱僻不遂”而生风。所以痰湿质是缺血性中风病发生时生痰、生疾、生风形成的重要内在基础。现代医学认为缺血性中风病具有多危险因素、多发病机制，其发病与个体的先天遗传因素和后天诸多因素均有相关性，且随着危险因素的增多，其发病的可能性也增加，从而导致了该病临床病因复杂，证型多变[7]。本研究亦证明了痰湿质与缺血性中风病具有显著的相关性。且痰湿质患者在体质量、体重指数、腰围、体质得分方面均高于非痰湿质患者，揭示了痰湿质在缺血性中风病中的体质倾向，临床中通过调治体质预防缺血性中风病时就可以更加有效的有针对性截断其发病去路，防其生变，这对缺血性中风病防治具有一定的参考作用。endprint

413缺血性中风病患者体质与证候关系

中医认为疾病的发生乃因阴阳失调，脏腑生理功能紊乱，心理失调产生的，是一个复杂的过程，但总体不外乎正邪相争这一基本的矛盾斗争过程。证候随体质转化而转化，体质是产生病证异同的关键关键所在，诊治原则必须从于体质，体质的特殊性决定着疾病发病后临床证候类型的倾向性。“证”的特征中包含着体质的特征[8]。体质与证候关系密切，体质辨证是中医辨证论治的延伸，也是指导临床辨证用药的重要依据。自古代起，中医一直遵循“辨体辨病辨证”相结合的诊疗模式，近几年来由于只强调辨证论治，忽略、淡化辨体，致使临床思维局限，理论覆盖不全，诊疗水平下降。在此基础上，王琦提出“辩体论治”思想。强调“治病求本， 体质为本， 病证为标”。张景岳在《景岳全书·卷之四十四烈集》中说“当识因人因证之辨。盖人者，本也；证者，标也。证随人见，成效所由。故当以人为先，因证次之。”

研究显示痰湿质、平和质患者发病后多表现为风痰瘀阻证；气虚质患者发病后多表现为气虚血瘀证；阴虚质患者发病后易表现为阴虚动风证。

痰湿质、平和质患者中风痰瘀阻证患者居多。骆斌等[9]提出痰湿质与缺血性中风病密切相关。痰湿质者，偏嗜肥甘厚味，脾气虚弱，脾失健运，湿浊困脾，或脾气亏虚，气血不足，外感风邪，乘虚入体，气虚无力行血，血液运行瘀滞，风痰瘀阻塞络脉，形成风痰瘀阻证。本次研究结果显示，痰湿质人群患有风痰瘀阻证的占65%，对应关系分析亦显示痰湿质与风痰瘀阻证关系密切。平和体质是指人的脏腑精气平衡，无明显体质偏向。所谓“阴平阳秘，精神乃治”。其特点是正气充足，不易发病，但并不意味着不发病，若情志刺激、饮食偏嗜，劳倦失常、感受寒邪等导致机体正气亏虚，脉络空虚，风痰乘虚入中，滞于经络，发为中风。

气虚质患者发病后易表现为气虚血瘀证。《灵枢·天年》：“人生十岁，五是藏始定，血气已通……二十岁，血气始盛……六十，心气始衰……”五十岁，肝气始衰……六十岁，心气始衰……七十岁，脾气虚……八十岁，肺气衰……九十岁，肾气焦……百岁，五脏皆虚，神气皆去，故形骸独居而终矣。”阐释了生命过程中，人体气血的盛衰变化，随着年龄增加，气血日益亏虚。一项针对对老年人体质调查研究发现随着年龄的增长，气虚者明显增加[10]。老年患者气血不足，络脉空虚，风邪袭表，卫气不足，不能固护肌表，温煦之力差，更易致风邪入侵，气血痹阻经脉，导致缺血性中风病发生。李东涛等[11]研究显示，在疾病演变过程中，气虚质患者多表现出气虚血瘀证。而这与本研究具有一定相同之处。

阴虚质患者发病后以阴虚动风证患者居多。阴津具有化气生血的功能，阴液是气血盛衰和气血正常运行的物质基础，阴液不足无力运行气血。现代人多偏嗜油腻、肥甘、炙烤之类食物，日久则易出现虚热内生，阴液耗伤，进而导致脉道瘀滞，津液亏虚。阴虚患者，精血亏虚，水不涵木，阴不敛阳，肝阳浮越于外，阳气化风，气血上冲犯脑。阴虚热生于内，灼伤津液，津液不足，筋脉不得滋养，发为中风。万海同等[12]研究发现养阴生津方剂对血瘀证具有良好效果，亦从侧面印证了阴虚易导致瘀血产生。

研究结果提示：体质与证候之间有一定联系。一定程度上证实了体质是证候形成的前提和基础。患者个体的体质特点决定了证候类型，所以在临床诊疗中，应重视辨体与辨证的统一，因时、因地、因人制宜，通过掌握体质与证候之间的关联性，针对不同体质，提高正气，增强个体抗病能力，避免内邪自生，达到未病先防的目的。此外，亦可根据体质判断证候的倾向和疾病的预后，安未受邪之地，防止疾病的进一步演变。因此，研究体质与证候的关联性，可以更行之有效的预防缺血性中风病的发生。

42缺血性中风病患者证候与炎症相关蛋白关系

随着缺血性中风病发病机制研究的深入，脑缺血早期的炎症反应及其损伤作用引发研究者高度关注，临床试验研究、动物模型研究均支持炎症反应参与缺血性脑损伤，炎性细胞因子作为重要的免疫递质，被认为是其发病机制中的关键媒介。有研究者发现，血清IL6浓度越高，动脉粥样硬化发生的概率越大，并且IL6的含量随着梗死病灶体积的扩大而增高[13]。诸多研究认为，IL6能够刺激基质金属蛋白酶的合成，如IL6能够促进成纤维细胞释放MMP1和MMP2U43，亦能增加MMP9和MMP13的表达，进而调节基质金属蛋白酶的功能[1417]。Dziedzic T等[18]研究发现脑梗死后炎症反应增高，IL6水平明显升高，可作为治疗的靶点。

据相关研究显示，不稳定斑块内含有大量激活T淋巴细胞、肥大细胞等，在一定程度上证实了炎症反应在斑块的破裂中起决定性作用[19]而动脉粥样硬化斑块是否脱落又是导致缺血性中风病关键所在。MMP9能够破坏血脑屏障、引起炎症反应、诱发性脑损伤和血管源性脑水肿。血脑屏障受损后，活化的白细胞通过破坏了的血脑屏障渗出到脑组织内，释放的细胞因子、炎症介质，能够加快神经元的凋亡，加重脑损害，是造成斑块不稳定的关键酶，是影响斑块稳定性的重要因素[20]。Kalela等[21]研究发现随着MMP9浓度升高，血管狭窄加重，提示MMP9可以作为动脉粥样硬化及脑梗死等病情活跃的标志物，并可作为随访指标。MMP9能够降解血管基膜，使内皮通透性增加，白细胞、脂质成分、细胞因子等侵入內膜下，促进动脉粥样硬化的发生、发展。MMP9水平增高，导致斑块不稳定，易脱落形成栓子，是IS发生及再发的危险因素之一。

MMP9，IL6对缺血性中风病患者损伤与中医痰、瘀理论极其相似， MMP9，IL6与痰浊、瘀血之邪均为体内代谢病理产物，作为致病因素又易引起广泛的损害和多种病变；痰瘀结聚，日久不消，蕴而化毒，痰瘀侵蚀血管，损伤血管的完整性，亦可会导致MMP9，IL6水平升高[22]。这与本研究显示MMP9水平是痰湿质患者高发缺血性中风病的重要影响因素具有一定的相通之处。此外，本研究显示缺血性中风病风痰瘀阻证患者MMP9，IL6水平较其他证候高；大动脉型风痰瘀阻证患者MMP9，IL6水平明显高于小动脉型患者。提示缺血性中风病证候、亚型很可能受其含量变化影响。endprint

因此， MMP9，IL6失调可能对缺血性中风病的发生及预后产生影响，人为调整MMP9，IL6有可能成为治疗缺血性脑血管病的新途径。探讨IL6，MMP9水平与缺血性中风病之间的关系，为早期预防缺血性中风病的发生提供可靠依据，通过测定患者IL6，MMP9水平的高低，及时了解病情变化，指导临床用药，对提高患者的临床疗效与生存质量，降低其发病率具有重要意义。

43MTHFR C677T基因多态性与缺血性中风病关系

目前，关于MTHFR基因多态性研究较为广泛的是是位于MTHFR基因第4外显子的CT突变，可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起MTHFR酶的活性降低，该酶的生物学活性下降促进Hcy水平增高，而高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化的独立危险因素[23]。大量研究证实MTHFR 677位T突变是导致HHcy最关键遗传物质。本研究中，刘丙立等[24]的研究结果显示TT基因型Hcy浓度明显高于其他2个基因型Hcy浓度，这与本研究结果一致。但其Hcy浓度比较显示无明显统计学差异，这可能与本研究样本量较小有关。本研究基因检测结果显示61例患者中，非突变CC基因型共12例，突变基因型TT，CT基因型共49例；突变基因型是非突变基因型的4倍，基因多态性对Hcy 的影响与MTHFR耐熱性及活性改变有关，有文献报道[25]，TT型活性较正常下降50%～70%，而CT 型下降25%～30%，提示Hcy水平与MTHFR的基因型密切相关，此外，Hcy能够促进IL6，MMP9等炎症因子合成，损伤血管内皮，参与动脉粥样硬化形成[2627]， 因此，MTHFR C677T基因位点突变可能导致缺血性中风病发生。

431MTHFR C677T基因型与缺血性中风病患者证候关系

痰浊与瘀血，皆属于人体津血代谢失常的病理产物，津血同源，痰源于津，瘀本于血，津血在生理上同源，由此推论，痰瘀在病理上则具有相关性。气血津液运行障碍，则水湿内停或血停为瘀。一定条件下二者在又可相互转化，相兼为病。瘀血内停，瘀阻血脉，影响津液输布，水液聚为痰浊；而痰凝不散也可继发血瘀病证。因此，痰、瘀是中风病病理基础中的重要环节。本研究显示风痰瘀阻证是缺血性中风病高发证候类型，风痰瘀阻证患者发病后其MTHFR C677T基因型易表现为TT基因型。在一定程度上，推论TT基因型与缺血性中风病风痰瘀阻证病理基础产生具有相关性，由此推断，MTHFR突变TT基因型可能是缺血性中风病风痰瘀阻证高发的分子生物学机制之一，其不同基因型可能成为指导临床辨证用药的参考指标之一。

432MTHFR C677T基因型与缺血性中风病患者体质关系

中医认为体质决定个体对某种致病因素的易感性，本研究显示痰湿质是缺血性中风病的高发体质类型。痰湿质的高分布频率说明该体质对缺血性中风病具有较高的易感性。痰湿质患者CC基因型3个，TT基因型14个，突变基因型发病风险是非突变型患者的46倍，且痰湿质与MTHFR C677T基因多态性对应分析中显示MTHFR C677T基因的CT基因型患者发病后易表现为痰湿质，此外，Logistic回归分析亦显示饮酒、CT基因型是痰湿质患者发病易感因素。MTHFR C677T位点突变的CT基因型使痰湿质患者发病风险增高。中医认为痰湿质是体内水液运行障碍，导致气机、血液运行不畅，损伤血管内皮，导致血管病变与凝血异常，这些病理改变是缺血性中风病发病关键因素，所以笔者认为CT基因型可能与痰湿质病理机制具有相关性，MTHFR C677T位点的突变，产生的CT基因型可能是痰湿质高发缺血性中风病的分子生物学机制之一[2829]。

体质与MTHFR基因多态性分析显示CT基因型发病后易表现为痰湿质，而在证候层面则表现为阴虚动风证。体质具有相对稳定性，而证候具有动态性，痰湿质乃因脏脏功能失调，水液运化障碍，水湿内停，聚湿成痰，痰湿内蕴，现在社会生活节奏快，压力大，长期精神紧张，或烦劳过度，易致痰郁化热，灼伤阴液，耗伤阴津，且本病患者多位中老年人，本身阴液不足，阴不制阳，阳亢化风，气血上逆，猝然发病。

44缺血性中风病体质、证候、炎症相关蛋白、MTHFR基因多态性的关系

本研究应用多重对应分析对缺血性中风病患者体质、证候、炎症相关蛋白、MTHFR基因多态性四者之间的关系进行分析显示痰湿质与风痰瘀阻证之间有联系，气虚质与气虚血瘀证之间有联系，证候、体质与验证相关蛋白以及MTHFR基因多态性之间关系较弱，究其原因，可能与本研究样本量较小有一定关系，因而对于体质、证候、炎症相关蛋白、MTHFR基因多态性之间关系需在大样本前瞻性研究基础上加以验证。

SNP是人群中分布最为广泛的一种基因多态，是中医辨证的分子生物学基础，从疾病相关基因多态性分布层面出发研究不同证型IS发病机制，为临床证候的诊断提供分子生物学依据，对于探讨缺血性中风病发病机制具有重要作用。本研究初步探究缺血性中风病证候、中医体质与MTHFR基因型之间的相关性，由于本研究样本量较小，其结果可能有一定的偏差，在未来研究中将扩大样本量，进一步探讨缺血性中风病证候、体质、基因多态性之间关系。

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[责任编辑张燕]endprint