基于代谢组学方法的姜黄素抗抑郁作用生物标志物初步筛查

2017-10-20马致洁张祎董捷鸣于小红赵小梅浦仕彪

中国中药杂志 2017年18期

马致洁张祎董捷鸣于小红赵小梅浦仕彪

[摘要]該文运用代谢组学的技术手段寻找与姜黄素干预抑郁模型大鼠相关的潜在标志物，从而探究姜黄素用于抗抑郁的作用机制。选取健康雄性SD大鼠随机分成4组，采用慢性不可预知温和应激（CUMS）刺激造模，造模2周后灌胃姜黄素（200 mg·kg-1）、文拉法辛（40 mg·kg-1）、空白组和模型组同时灌等体积的1% CMCNa生理盐水，每天1次，连续2周。采集大鼠血清并采用LC/MSITTOF方法对各组血清代谢差异进行表征，利用多元统计分析方法筛选出可能的潜在生物标志物并分析其可能的代谢通路。在分别给予姜黄素和文拉法辛后，CUMS模型组大鼠的抑郁各项指标均有显著性改善（P<005），但姜黄素和文拉法辛组之间则无明显差异；通过PCA和PLSDA分析，经姜黄素或文拉法辛干预后，CUMS模型组大鼠体内的小分子代谢物水平体现出恢复正常的趋势，而且姜黄素组尤为明显；通过代谢组学技术手段，从中筛选得到11个与姜黄素抗抑郁功效相关的生物标志物，同时涉及到7条代谢通路。研究表明姜黄素具有确切的抗抑郁作用，其在宏观和微观层面均有体现，可与阳性药物文拉法辛相比；姜黄素在体内可能是通过影响甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变及醚脂类代谢等发挥抗抑郁功效，今后还需进一步探索。

[关键词]姜黄素；抗抑郁；代谢组学；生物标志物； CUMS模型

Preliminary screening of biomarkers for curcumin′s antidepressant

effect based on metabonomics method

MA Zhijie1，2， ZHANG Wei1， DONG Jieming2， YU Xiaohong2， ZHAO Xiaomei2， PU Shibiao1*

（1 College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China；

2. Beijing Friendship Hospital， Capital Medical， Beijing 100050， China）

[Abstract]To screen potential biomarkers of curcumin related to treating depression rats by using metabolomics means， so as to explore the antidepressant action mechanism of curcumin The healthy male SD rats were randomly divided into four groups Chronic unpredictable mild stress （CUMS） stimulation was conducted for modeling for 2 weeks， and then curcumin （200 mg·kg-1） or venlafaxine （40 mg·kg-1） was given by gavage administration The blank group and model group rats were given with the same volume of 1% CMCNa normal saline， once per day for two weeks The rats serum for each group was collected and LC/MSITTOF method was used to characterize the metabolic differences Also multivariate statistical analysis was used to screen possible potential biomarkers and analyze the possible metabolic pathways After administration of curcumin and venlafaxine respectively， the depression indexes of CUMS model rats were all improved significantly （P<005）， but there were no significant differences between curcumin and venlafaxine groups In PCA and PLSDA analysis after curcumin or venlafaxine intervention on CUMS model group rats， the small molecule metabolites level reflects a normal trend， and particularly for the curcumin group Through metabonomics technology， 11 biomarkers associated with curcumin antidepressant effect were screened， and at the same time seven metabolic pathways were involved The results showed that curcumin had antidepressant effects， which was evident in both macro and micro levels， comparable with positive drug of venlafaxine The antidepressant effect of curcumin may be associated with the glycerol phospholipid metabolism， linoleic acid metabolism， pentose and glucuronic acid ester and ether lipid metabolism， but still need further exploration in the future.endprint

[Key words]curcumin； antidepressant； metabonomics； biomarkers； CUMS model

姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa L的干燥根茎。主产于中国、印度、日本等国家，是临床常用中药。姜黄素（curcumin）则是从姜科植物姜黄属姜黄、莪术、郁金等根茎中提取得到的1种天然黄色色素，为小分子植物酸性多酚，其分子式为C21H20O6，相对分子质量 36837。近年来大量的研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗呕吐、抗纤维化、抗人类免疫缺陷病毒保护神经系统等作用，其药理药效十分广泛[1]。近年来，PubMed数据库上收录的有关姜黄素药用价值的文献数量也迅速增多，姜黄素成为医疗保健领域新的研究热点之一，具有广阔的开发与应用前景。

研究显示，姜黄素具有抗抑郁作用，但是抗抑郁的作用机制仍不清楚[2]。慢性温和不可预知应激模型是1种经典抑郁症动物模型，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机制更为接近[3]。代谢组学是研究机体代谢产物变化的1种新的系统生物学方法，其通過揭示新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律，较全面了解病理变化过程及机体内物质的代谢途径，在实验动物模型评价、病理机制研究及药物疗效评价中展现了其特色和优势[46]。本研究拟在前期研究基础上，采用慢性温和不可预知应激模型评价姜黄素的抗抑郁作用，同时采用LC/MSITTOF方法表征姜黄素干预抑郁模型大鼠血清内源性代谢物的变化差异，通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别（PLSDA）分析，筛选姜黄素抗抑郁作用的内源性小分子生物标志物，并结合代谢通路数据库，探讨可能的作用机制和通路，为进一步阐明姜黄素抗抑郁作用机制提供参考。

1材料与方法

11仪器与试药高效液相色谱离子阱飞行时间串联质谱仪（LCMSITTOF，日本岛津Shimadzu）；radient A10 MillQ超纯水器（美国 Millipore 公司）；冷冻离心机（Sigma，德国）；微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士）；涡旋混匀器（HYQ 2121A）；自制旷场行为测试箱（长宽高为100 cm×100 cm×80 cm）、秒表、电击仪、烘箱、冰水游泳桶等。色谱柱为Waters XBridgeC18（21 mm×150 mm，35 μm）离子源为ESI±；毛细管电压为3 500 V；扫描范围m/z 50～1 000；碰撞能为7 eV；锥孔能为5 eV；脱溶剂气流量为60 L·min-1；脱溶剂气温度为180 ℃。

甲醇（色谱级，Fisher Scientific）、去离子水经（182 MΩ）Millipore MilliQ系统（Millipore Co，美国）超纯水器净化，其他试剂均为市售分析纯。姜黄素购自美国Sigma公司，盐酸文拉法辛胶囊（25 mg/粒）购自成都康弘药业集团股份有限公司。

12动物分组与给药SD大鼠32只，SPF级，体质量（180±20） g左右，雄性，购于军事医学科学院实验动物中心（合格证号SCXK军2014004）。大鼠饲养于屏障动物房，室温（20±2） ℃，相对湿度60%～70%，通风良好、环境安静，室内保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。将SD大鼠随机分为4组，正常对照组、CUMS模型组、姜黄素（200 mg·kg-1）干预组，盐酸文拉法辛（40 mg·kg-1）组，每组8只。除空白组外，所有动物前2周只造模不给药，后2周边造模边给药，给药组分别灌胃相应的药物，空白组和模型组灌胃等量1% CMCNa生理盐水；其中按照给药设定剂量，姜黄素和盐酸文拉法辛药物均采用相应体积的1% CMCNa生理盐水进行溶解。

13造模方法慢性温和不可预知应激（CUMS）程序进行抑郁造模，造模过程与参考文献[79]的方法并加以改进。模型组和给药组给予的刺激因素包括禁食、禁水、4 ℃冰水游泳、50 ℃热应激、夹尾、电击足底、潮湿垫料和鼠笼倾斜45 °、束缚应激、陌生物品、噪音刺激。每日随机给予1种刺激，保证在整个造模过程中每种刺激累计使用2～3次，顺序随机，应激持续28 d。

14体质量和糖水偏爱试验造模第0，7，14，21，28天分别测定大鼠体质量；糖水偏爱试验方法参考文献[10]，在动物造模前1周对其进行糖水偏爱训练，造模第0，7，14，21，28天分别测定纯水和糖水消耗量，以糖水偏爱率为评价指标，糖水偏爱率=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

15旷场试验分别在造模开始前1天和开始后第14，28天将单只大鼠放在自制的旷场

箱（长宽各80 cm，高40 cm）中央，敞箱底分为16个方格，用黑漆涂满内壁，记录大鼠5 min内的活动：观察指标包括中央格停留时间（自大鼠被放入中央格至大鼠3只爪子跨离开该格的时间，用s计）、水平格数（以穿越底面方格数为其水平得分，穿越1个格子计为1分）、垂直运动（两前腿离地或爬墙壁计为1次）、理毛时间和粪便。并在彻底清洁敞箱后进行下只动物的测定[11]。

16样品采集与处理于末次给药后，眼眶静脉取血，分离血清后置于-80 ℃冰箱，检测前将大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，复融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混匀，静置，4 ℃下冷冻离心，1万 r·min-1，10 min，取上清，并用022 μm微孔滤膜滤过，进样。

17数据处理与分析数据以±s表示。运用SPSS 180软件进行单因素方差分析（ANOVA）统计处理，两两比较采用LSD检验，以P<005作为差异存在统计学意义的界限。代谢组学质谱数据采用Mzmine 25软件进行色谱峰识别，再将数据导入SIMCAP11软件，标准化后进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别（PLSDA）分析。接着运用variable influence in the projection（VIP）方法来预测各个数据对模型的贡献值，VIP>1说明具有明显的贡献，有统计学意义，为可能的潜在标志物。再采用Oneway ANOVA的方法，根据P<005的原则，排除没有显著性差异的数据。通过这一系列步骤之后，将具有统计学意义的数据在Human Metabolome Database（HMDB）、KEGG数据库中进行匹配，筛选潜在的生物标志物；最后在Metabo Analyst 30数据库中分析可能的代谢通路变化。endprint

2结果

21行为学实验以体质量、糖水偏爱率和旷场行为作为CUMS造模的行为学评价指标，本研究中，与正常对照组相比，第28天数据显示：模型组大鼠体质量增长缓慢、糖水偏爱率低、穿格数和直立次数明显偏少（P<005或P<001），表明造模过程中慢性温和不可预知的刺激造成大鼠的食欲下降、快感缺乏、运动和探索能力下降，造模成功。连续给予姜黄素干预后，与模型组相比，大鼠体质量、糖水偏爱、穿格和直立次数均增高（P<005），但与盐酸文拉法辛组相比较，各项指标则无明显差异（表1）。

22血清PCA分析通过PCA主成分分析，结果显示第28天时各组大鼠分布在不同的区域中，正常对照组和模型组分别分布于对立的2个象限中，而盐酸文拉法辛组和姜黄素大鼠则分布在上述2组之间的中心区域内（图1）。由此可见，在实验过程中，随着造模措施的持续进行，模型组大鼠体内的小分子代谢物水平出现了显著性的变化，而通过分别给予盐酸文拉法辛和姜黄素的干预措施后，体内的小分子代谢物则体现出向正常水平恢复的趋势。再者，姜黄素组相比于文拉法辛组，要更接近于正常组一些。

23血清PLSDA分析PLSDA方法是在PCA分析的基础上，增加了有监督性的分级干预，旨在放大组间差异，以便于寻找潜在的生物标志物。其中ScorePlot图中也分别展现出了各组大鼠在第28天时的分布区域，与PCA分布图大体相似；loadingplot则进一步展现出了拟合模型中的各个小分子代谢物在各组间的分布水平；模型验证图则可以验证PLSDA模型的拟合准确度与预测率（图2～4）。

24生物标志物筛查通过偏最小二乘判别分析方法（PLSDA）进行分析，选择VIP>1的潜在标志物在HMDB，metlin，KEGG数据库中鉴别。其中，共初步筛选出11个潜在的生物标志物（表2）。在筛选得到的潜在生物标志物中，1和7为溶血磷脂酰乙醇胺类物质，2为磷酯类物质，3为神经节苷脂类物质，4，5，6，8，11为溶血卵磷脂类物质，9为磷脂酰丝氨酸类物质，10为脱氧胆酸类物质。其中，治疗药物姜黄素和盐酸文拉法辛通过上调或下调CUMS大鼠体内生理水平出现异常的生物标志物，使之恢复至正常水平或处于向正常水平的恢复过程中。

25生物通路分析将所筛选得到的潜在的生物标志物输入至Metabo Analyst 30数据库中进行通路分析，结果显示这些潜在的生物标志物共涉及到7条通路，分别是甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α亚油酸代谢、醚脂类代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变、淀粉和蔗糖代谢和花生四烯酸代谢（图5）。

3讨论

抑郁症是1种情志障碍性疾病，严重危害身体健康。究其发病机制目前尚未十分明确，临床中针对于抑郁症的诊断也存在一定的困难[12]。现代科学研究中有使用代谢组学的技术手段探讨抑郁症的发病机理以及治疗靶点，通过分析抑郁症机体内的小分子代谢物含量水平的变化，筛选出具有一定诊断价值的生物标志物，进而作为临床中用于诊断抑郁症的潜在金标准[13]。而姜黄素作为经典方剂逍遥散中独特味药姜黄的主要作用成分之一，目前已有大量的研究文献针对其抗抑郁功效进行了报道，然而其确切的发生作用机制也未十分明确，尤其是姜黄素发挥抗抑郁作用过程中单个靶点或多个靶点，以及通过影响何种代谢通路发挥功效等焦点，需要我们进一步的研究证实[14]。因此，本文以阳性药物文拉法辛作为对照药，观察姜黄素作用于CUMS模型抑郁症大鼠中的作用，并筛选与姜黄素产生作用相关的潜在生物标志物，进而分析这些生物标志物所涉及到的一系列代谢通路。

通过PCA和PLSDS的代谢组学数据分析手段，分析结果显示：姜黄素组与文拉法辛组均表现出向正常大鼠恢复中的趋势，而且姜黄素组大鼠尤为明显。结合两组在抑郁症相关指标的变化水平，可以认为姜黄素和文拉法辛均具有一定的抗抑郁功效，且在某种程度中，姜黄素的作用水平稍强于文拉法辛，这在PCA和PLSDA的分布图中可以清晰地展现出来。当然这种现象也会受到不同药物的给药浓度设定以及给药时间周期所限，但不可否定的是，姜黄素的抗抑郁作用不弱于阳性药物文拉法辛。

再者，通过结合多元统计VIP值和单因素方差分析的统计学指标，选择VIP>1以及P<005的变量作为潜在的生物标志物在相关数据库中进行鉴定。最终筛选出11个生物标志物，这些标志物与姜黄素发挥抗抑郁功效的过程密切相关。其中，涉及到磷脂类、脂质类、胆酸类以及神经节苷脂类等，这些物质作为体内的小分子代谢物，在细胞合成、胆酸代谢以及神经因子调节方面发挥着重要的作用[15]。

同时，在这些已鉴定生物标志物的基础上，应用Metabo Analyst 30开放性数据库进行代谢通路分析，结果显示按照相关性排序，甘油磷脂代谢和亚油酸代谢排在前面；按照影响程度排序，戊糖和葡萄糖醛酸酯互变、醚脂类代谢和甘油磷脂代谢排在前面。在中医上[16]，历代医家多认为抑郁症之病因在于情志不舒、气机郁滞，导致气血不和、阴虚火旺和心神失养；现代医学者对于抑郁症的认识也日益深入，可能涉及到脑、肝、胆、心、脾、肾等体内多个器官和系统，不能一概而论。因此，姜黄素发挥抗抑郁的功效很有可能是通过作用于体内多条生理通道而实现，并不是单一的靶点，但限于当前技术手段以及科学认知水平，后续的深入探索需要有志者携手实现。

[参考文献]

[1]王卿姜黄素抗抑郁作用的临床调查[J]. 中国中医药现代远程教育，2014，12（10）：145.

[2]宋春联，王红伟逍遥散治疗抑郁症疗效观察[J]. 临床身心疾病杂志，2007（5）：454.

[3]赵静，魏立新，杜玉枝，等. 藏药佐太的抗抑郁抗焦虑作用研究[J]. 药物评价研究，2016，39（4）：522

[4]孟胜喜，霍清萍，王兵，等. 代谢组学技术在中医药防治缺血性脑血管病研究中的应用[J]. 中医杂志，2016，57（17）：1515.

[5]李先娜，董辉，孙晖代谢组学在中医药现代化研究中的应用[J]. 中医药信息，2016，33（5）：114.

[6]李长明，李玲孺，陈禹，等. 应用代谢组学技术进行中医体质研究探讨[J]. 中医药学报，2016，44（2）：1.

[7]匡胜男，罗映，田小燕，等. 美洛昔康改善慢性应激大鼠抑郁行为的机制初探[J]. 中国药理学通报，2016，32（2）：263.

[8]于泽胜，路腾飞，周好波，等. 柴胡白芍药对对慢性温和不可预知性应激抑郁模型大鼠脑内单胺类神经递质的影响[J]. 中草药，2016，47（16）：2887.

[9]瞿小蘭，付小佩，舒雅桥，等. 氟西汀对小鼠慢性不可预知温和应激所致学习记忆减退的改善作用[J]. 现代中西医结合杂志，2016，25（28）：3085.

[10]孙秀萍，杨久山，徐艳峰，等. 慢性给予皮质酮对小鼠抑郁样行为和突触素的影响[J]. 中国比较医学杂志，2016，26（1）：14.

[11]陈巨星，向丽红，邵鸿增，等. 大鼠抑郁症模型中糖皮质激素作用机制的研究[J]. 世界最新医学信息文摘，2016，16（68）：129.