益母草饮片标准汤剂研究

邓哲 张凡 章军 张庆 焦梦姣 张国瑗 程锦堂 刘安 王跃生

[摘要]建立益母草饮片标准汤剂质量评价标准。制备13批不同品质的益母草饮片标准汤剂，对盐酸益母草碱和盐酸水苏碱进行含量测定、计算其转移率、测定出膏率及pH、建立HPLC指纹图谱分析方法。结果13批益母草饮片标准汤剂中盐酸益母草碱和盐酸水苏碱转移率分别为300%～534%，670%～826%，干膏得率121%～183%，pH 587～622，并用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）软件进行指纹图谱分析，确定了12个共有峰，对13批益母草饮片标准汤剂分别进行相似度评价，其相似度均大于09。该研究中益母草饮片制备方法规范，指纹图谱相似度高，其方法精密度、稳定性和重复性良好，可为益母草配方颗粒质量控制提供参考。

[关键词]益母草； 标准汤剂； 盐酸益母草碱； 盐酸水苏碱； 指纹图谱

Standard decoction of Leonuri Herba

DENG Zhe1，2， ZHANG Fan3， ZHANG Jun1， ZHANG Qing1， JIAO Mengjiao1， ZHANG Guoyuan1，

CHENG Jintang1， LIU An1， WANG Yuesheng1*

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China；

3. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

[Abstract]To build an evaluation standard for quality of Leonuri Herba standard decoction 13 batches of Leonuri Herba standard decoction with different quality were prepared The contents of leonurine hydrochloride and stachydrine hydrochloride were determined； then the transfer rate and the extract rate were calculated and pH value was measured； and HPLC fingerprint method was established for analysis The results of 13 batches of samples revealed that the transfer rate of leonurine hydrochloride and stachydrine hydrochloride was 300%534% and 670%826%， respectively； the extract rate was 121%183% and the pH value was 587622 Moreover， 12 common chromatographic peaks were determined based on fingerprint by using Similarity Evaluation System for Chromatographic fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2012A） The similarity of 13 batches of samples was analyzed and compared， and the results showed that the similarity was higher than 09 In this study， the preparation method for Leonuri Herba decoction was standard， with high similarity in fingerprint， showing high precision， stability and repeatability in fingerprint analysis Thus， this study can provide a reference for the quality control of Leonuri Herba dispensing granules

[Key words]Leonuri Herba； standard decoction； leonurine hydrochloride； stachydrine hydrochloride； fingerprint

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒等功效，临床常用于月经不调、痛经闭经、产后恶露不尽、水肿尿少、疮疡肿毒等病症。因其疗效显著，享有“妇科要药”“经产良药”之美誉。除此之外，现代研究表明益母草潜在多种药理活性，主要表现在对血液系统（如改变血液流变学、改善微循环等）、心血管系统（如保护心肌细胞、抗心肌缺血等）及免疫系统等方面以及还有抗炎镇痛、抗氧化、降血糖、美容等作用[16]。因此，益母草的成方制剂也极其的多。经统计，关国家食品药品监督管理总局批准的仅由单味益母草组成的制剂就多达16个，包括益母草颗粒、益母草膏、益母草片、益母草注射液等等，这些产品由遍及全国30个省份292家药品生产单位生产。可见益母草在临床发挥作用之巨大，其确切的疗效已被大众所认可。endprint

如今，为适应现代人中药服用方式的需求，具有“净、便、小、恵、精、稳”优势的中药配方颗粒盛行。国家也出台了一系列政策、文件助推中药配方颗粒产业良好发展。然而，由于缺乏规范的生产工艺、质量标准和精准的临床用量阻碍了中药配方颗粒产业进一步发展。中药标准汤剂[7]应运而生，目的是建立中药配方颗粒质量标准体系，确保中药配方颗粒质量稳定、均一，临床应用安全、有效。益母草诚然已是一个中药大品种，并且关于它的研究文献颇多[89]，但尚未见对其标准汤剂的研究报道。因此，有必要开展益母草饮片标准汤剂研究，建立质量标准，为益母草配方颗粒及其所有水提制剂提供标准参照，保证产品质量稳定、均一，同时也为国家有关部门提供数据支撑，便于市场产品监管。

1材料

11仪器与试剂

岛津LC20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，DGC20 A型在线脱气系统，SIL20 A型自动进样系统，CTO20 A型柱温箱，SPDM20 A型二极管阵列检测）；Agilent Technologies 1200 Series型高效液相色谱仪（Alltech 3300 ElSD检测器）；BS224S型1/10万电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorious BS 210 S型电子天平；盐酸益母草碱对照品（江西佰草源生物科技有限公司，纯度≥98%，批号250066201604）；盐酸水苏碱对照品（江西佰草源生物科技有限公司，纯度≥98%，批号250054201602）；乙腈为色谱纯（美国Fisher），水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

12样品

分别收集了5个产地、10个厂家不同质量的17批益母草饮片。其具体信息见表1。

2方法和结果

21益母草饮片含量测定

按照2015年版《中国药典》方法，以色谱柱Agilent Eclipse XDBC18（46 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈04%辛烷磺酸钠01%磷酸水（24∶76），流速1 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长277 nm为色谱条件测定盐酸益母草碱含量；以色谱柱Agilent Technologies venusil HILIC（46 mm×250 mm，5 μm，100A），流动相乙腈02%冰醋酸（80∶20），流速08 mL·min-1，柱温40 ℃，蒸发光散色检测器（Alltech 3300 ELSD，温度55 ℃，气体流量20 L·min-1，增益2）为色谱条件测定盐酸水苏碱含量。见表2。

22益母草饮片标准汤剂制备

按照《中药饮片标准汤剂研究策略》[7]中建议的工艺参数将合格的13批益母草饮片制备标准汤剂，即取益母草饮片100 g，至2 000 mL圆底烧瓶中，加12倍量水充分浸润30 min，加热煮沸后回流30 min，趁热过滤（200目筛网），药渣再加10倍水，加热煮沸后回流20 min，趁热过滤（200目筛网），合并2次滤液，减压浓缩至适量，定容至500 mL，摇匀，得到规格为02 g·mL-1的益母草饮片标准汤剂。

23益母草饮片标准汤剂含量测定

231盐酸益母草碱含量测定

2311色譜条件色谱柱CAPCELLPAK C18（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）01%磷酸水（B），梯度洗脱（0～30 min，10%～20%A；30～35 min，20%～35%A）；柱温35 ℃；流速1 mL·min-1；检测波长277 nm；进样体积10 μL。在此条件下盐酸益母草碱与其他成分分离良好，见图1。

2312对照品溶液制备取盐酸益母草碱对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2313供试品溶液的制备取益母草饮片标准汤剂摇匀，精密吸取1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇至接近刻度，超声处理10 min，冷却，50%甲醇定容，摇匀，过045 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2314线性关系考察精密吸取2312项下的盐酸益母草碱对照品溶液1，2，3，4，5 mL，分别置于5 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，按2311项下方法进样，测定盐酸益母草碱的峰面积，以盐酸益母草碱的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算得到回归方程Y=1 106 942X+8 4307，R2=0999 7，线性范围006～036 μg。

2315精密度试验取同一益母草饮片标准汤（YMC17）供试品溶液，按2311项下色谱条件方法连续进样6次，计算供试品溶液中盐酸益母草碱的峰面积的RSD为040%，表明仪器精密度良好。

2316重复性试验平行制备6份益母草饮片标准汤剂（YMC17）供试品溶液，按2311项下色谱条件进样，结果益母草饮片标准汤剂中盐酸益母草碱的平均质量分数为029 g·L-1，RSD 060%，表明该方法的重复性良好。

2317稳定性试验取益母草饮片标准汤剂（YMC17）供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，4，8，12，24 h按2311项下色谱条件测定，计算盐酸益母草碱的峰面积的RSD为13%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。

2318加样回收试验取已知含量的益母草饮片标准汤剂（YMC17），根据标准汤剂中盐酸益母草碱的含量按1∶1的比例添加盐酸益母草对照品（0133 4 mg），平行制备6份供试品溶液，按2311项下色谱条件进行试验，计算供试品溶液中盐酸益母草碱的平均加样回收率为9980%，RSD 16%，表明该方法的准确度较好。

2319样品测定精密吸取对照品溶液5 μL，供试品溶液10 μL，按2311项色谱条件分别测定13批益母草饮片标准汤剂盐酸益母碱的含量，每批平行2份，见表2。endprint

232盐酸水苏碱含量测定

2321色谱条件同测益母草饮片盐酸水苏碱的色谱条件。各成分分离良好，见图2。

2322对照品溶液制备取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含2092 μg的溶液，即得。

2323供试品溶液制备取益母草标准汤剂摇匀，精密量取 2 mL，置10 mL量瓶中，加25%甲醇至接近刻度，超声处理10 min，冷却，25%甲醇定容，摇匀，过045 μm微孔滤膜，即得。

2324线性关系考察精密吸取2322项下的盐酸水苏碱对照品溶液1，4，6，8，10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，按2321项下方法进样，测定盐酸水苏碱的峰面积，以盐酸水苏碱的进样量（μg）的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，得到回归方程Y=1296X+294，R2=0999 6，线性范围0418 4～4184 μg。

2325精密度试验取同一益母草饮片标准汤剂（YMC02）供试品溶液，按2321项下色谱条件方法连续进样6次，计算供试品溶液中盐酸水苏碱的峰面积的RSD为050%，表明仪器精密度良好。

2326重复性试验平行制备6份益母草饮片标准汤剂（YMC02）供试品溶液，按2321项下色谱条件进样，结果益母草饮片标准汤剂中盐酸水苏碱的平均质量浓度为088 g·L-1，RSD 070%，表明该方法的重复性良好。

2327稳定性试验取益母草饮片标准汤剂（YMC02）供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，4，8，12，24 h按2321项下色谱条件测定，计算盐酸水苏碱的峰面积的RSD 15%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。

2328加样回收试验取已知含量的益母草饮片标准汤剂（YMC02），根据标准汤剂中盐酸水苏碱的含量按1∶1添加盐酸水苏碱对照品（0438 8 mg），平行制备6份供试品溶液，按2321项下色谱条件进行试验，计算供试品溶液中盐酸水苏碱的平均加样回收率为1026%，RSD 19%，表明该方法的准确度较好。

2329样品测定分别精密吸取对照品溶液5，20 μL，供试品溶液10～20 μL，按2321项色谱条件进样，采用外标两点法对数方程计算益母草中盐酸水苏碱含量，每批平行2份，结果见表2。

24转移率、干膏得率及pH

转移率为汤剂中指标成分含量/饮片中指标成分含量×100%。分别以盐酸益母草碱、盐酸水苏碱为指标成分，计算转移率；干膏得率为取益母草饮片标准汤剂适量，摇匀，精密吸取10 mL置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称定质量，每批平行2份；pH用pH计（Sartorius PB10）测定，见表2。

25指纹图谱的建立

251色谱条件

同2311项色谱条件。

252供试品溶液

制备同2313项下供试品溶液制备方法。

253精密度试验

取同一批益母草饮片标准汤剂供试品溶液，按2311项下方法连续进样6次，以盐酸益母草碱（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间RSD<030%，相对峰面积RSD<80%，表明仪器精密度良好。

254重复性试验

平行制备6份益母草饮片标准汤剂供试品溶液，按2311项下方法进样，测定供试品溶液中各共有峰的保留时间和峰面积。以盐酸益母草碱（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间的RSD<040%，相对峰面积的RSD<80%，表明该方法的重复性较好。

255稳定性试验

取益母草饮片标准汤剂供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0，2，4，8，12，24 h按2311项下方法进样测定，以盐酸益母草碱（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果各峰相对保留时间的RSD<060%，相对峰面积的RSD<65%，表明益母草饮片标准汤剂供试品溶液在24 h内稳定。

256样品检测与分析

分别取13批益母草饮片标准汤剂，按2313项下方法制备供试品溶液，再按2311项下色谱条件分别测定，记录HPLC图，见图3。将13批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A），以YMC01色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为01，进行相似度计算，见图4，表3。结果发现13批益母草饮片标准汤剂与对照指紋图谱相似度均>09，表明各批次益母草饮片标准汤剂具有较好的一致性。

3讨论

31样品来源

本研究共收集了17批不同品质的益母草饮片，分别产于河北、安徽、江西、湖北和山东5个产地，来自10个不同的厂家，包括不同等级、不同批次和不同年份的饮片。其中13批样品中的盐酸益母草碱和盐酸水苏碱均符合药典限量标准要求，另存在4批不合格样品，均为盐酸水苏碱达不到药典标准。益母草中盐酸水苏碱不合率较高，这与文献报道相一致[10]。因此，选取合格的13批益母草饮片为研究对象进行益母草饮片标准汤剂研究。

32供试品前处理

盐酸益母碱含量测定中供试品溶液制备以盐酸益母草碱含量为指标，考察了不同浓度溶剂（25%，50%，75%，100%甲醇；25%，50%，75%，100%乙醇）、不同稀释倍数（10，25，50倍）和不同超声时间（10，20，30 min）等因素，结果不同浓度甲醇处理益母草碱的峰型优于不同浓度的乙醇处理，且不同浓度甲醇处理盐酸益母草碱含量接近，综合考虑，选取50%甲醇。其稀释倍数和超声时间对盐酸益母草碱含量几乎没有影响。所以选取50%甲醇、中间稀释倍数25倍、最短超声时间10 min为测盐酸益母草碱的供试品溶液制备方法。盐酸水苏碱含量测定供试品制备同样也考察了不同浓度溶剂（25%，50%，75%，100%甲醇和1%盐酸甲醇）、不同稀释倍数（5，10，25倍）和不同超声时间（10，20，30 min）等因素，结果显示不同浓度溶剂中含醇量越低，盐酸水苏碱含量相对较高，而稀释倍数和超声时间对盐酸水苏碱含量几乎没有影响，所以选取25%甲醇、中间稀释倍数10倍、最短超声时间10 min为盐酸水苏碱含量测定的供试品制备方法。endprint

33色谱条件

色谱条件重点考察了色谱柱和流动相系统。盐酸益母草碱含量测定尝试了Agilent Eclipse XDBC18（46 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Synergi 4 μ PolarRP 80A（46 mm×250 mm，4 μm）和CAPCELLPAK C18（46 mm×250 mm，5 μm）等3种不同型号的色谱柱和乙腈水、乙腈01%磷酸水和乙腈04%辛烷磺酸钠01%磷酸水等3种不同的流动相系统，结果色谱柱为CAPCELLPAK C18（46 mm×250 mm，5 μm）、流动相乙腈01%磷酸水所得色谱图峰型最好。盐酸水苏碱因没有紫外吸收，因此需采用配有蒸发光散色检测器的高效液相色谱仪测定。不过也有相关文献报道[1112]用HPLC在192 nm下测定益母草及其制剂中盐酸水苏碱含量，本研究试图用HPLC测定盐酸水苏碱含量，采用强离子交换色谱柱Allsphere SCX（46 mm×250 mm，5 μm），乙腈005 mol·L-1磷酸二氢钾溶液磷酸（15∶85∶015）为流动性，检测波长192 nm。结果对照品峰型较好，但样品分离不好且严重的基线漂移。可能原因是样品中其他化学成分和杂质的干扰。因此，最终选择了HPLCELSD，采用益母草饮片中盐酸水苏碱含量测定方法测定汤剂中盐酸水苏碱含量，即益母草饮片和汤剂中盐酸水苏碱含量测定色谱条件是同一条件。

34指标成分和指纹图谱

益母草化学物质丰富，涵盖生物碱类、黄酮类、二萜类、苯乙醇苷类、酚酸类、脂肪酸类、挥发油类、多糖类等化合物[13]，其生物碱类已被证明是益母草的主要活性成分，特别是益母草碱[14]和水苏碱[15]具有广泛且较强的药理活性，已成为益母草及其制剂质量控制的主要成分指标。因此，本研究选用盐酸益母草碱和盐酸水苏碱为成分指标，计算其转移率，能体现标准汤剂的内在质量。因盐酸水苏碱采用HPLCELSD，灵敏度较低，故不做指纹图谱研究。仅对盐酸益母草碱做指纹图谱研究也能成整体上控制益母草饮片标准汤剂的质量。其中12个共有峰，8号峰为丁香酸、9号峰为盐酸益母草碱，其他峰还需进一步深入研究、指认，以便明确汤剂中主要的药效物质基础。

35标准汤剂的应用

标准汤剂由标准化和规范化的生产工艺制备，并制定了具体的参数范围和汤剂特征图谱，从定量定性两个方面整体把控标准汤剂质量。为不同批次、不同厂家的产品标化，保证临床剂量的一致性提供参考数据。同样，本研究建立的益母草饮片标准汤剂有具体的指标成分转移率、干膏得率和pH等参数范围和明确的特征图谱。因此，它适用于益母草配方颗粒在内的多种用药形式评价，且能为有关监管部门提供数据资料，具有很强的实际意义。

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[责任编辑孔晶晶]endprint