醋甘遂活性部位各成分群对斑马鱼胚胎的急性毒性比较研究

楼坚伟+曹亮亮+张桥+张丽

[摘要]采用模式生物斑马鱼的胚胎评价醋甘遂活性部位各成分群急性毒性，同时采用UFLCQTOFMS对各成分群的化学成分进行定性研究。以24 h健康斑马鱼胚胎为研究对象，各成分群设9个浓度和1个空白对照组，考察给药后96 h其对斑马鱼胚胎存活率的影响，计算不同样品对斑马鱼胚胎的半数致死浓度（LC50）。结果显示，各成分群对斑马鱼胚胎的急性毒性大小依次为B>C>A>D，成分群D的毒性不明显。UFLCQTOFMS分析结果显示成分群B主要检测到巨大戟烷型二萜类成分，成分群C主要检测到假白榄烷型二萜类成分。关联毒性研究结果，推测假白榄烷型二萜类成分可能为醋甘遂中更为低毒的活性成分，可为进一步深入探究醋甘遂“有故无殒”的物质基础提供依据。

[关键词]醋甘遂； 成分群； UFLCQTOFMS； 斑马鱼胚胎； 急性毒性

Comparative study on acute toxicity of different active ingredient

fractions from Kansui stirbaked with vinegar on zebrafish embryos

LOU Jianwei， CAO Liangliang， ZHANG Qiao， ZHANG Li*， DING Anwei

（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and

Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract]The 24 h normal developing zebrafish embryos were used to evaluate the acute toxicity and the compounds of respective fractions were analyzed by UFLCQTOFMS simultaneously Nine concentration groups with respective concentration and a blank control group were designed for each fraction to investigate their effect on survival rates of zebrafish embryos 96 h after drug administration， and calculate the median lethal concentration （LC50） of different fractions to zebrafish embryos The results showed that all of the fractions had acute toxicity to zebrafish embryos except VEKD， and the order was as follows： VEKB， VEKC， VEKA and VEKD According to the results of UFLCQTOFMS， the chemical ingredients contained in VEKB and VEKC were mainly composed of ingenanetype and japhanetype diterpenoids， respectively It could be speculated that japhanetype diterpenoids might be the active compounds with lower toxicity associated with the results of toxicity study， providing some references for the further research on effective material basis of Kansui stirbaked with vinegar according to the principle of "drastic medicine， no death risks"

[Key words]Kansui stirbaked with vinegar； ingredients； UFLCQTOFMS； zebrafish embryos； acute toxicity

中药甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui TN Liou ex TP Wang的干燥块根[1]。性味寒苦，有毒，常用于治疗胸腹积水、二便不利等症，临床内服需醋炙，以降低毒性及缓和药性。本课题组前期从腹水量、尿量、对肾素血管紧张素Ⅱ醛固酮系统的影响等多方位考察了醋甘遂各极性部位对Walker256癌性腹水模型大鼠的泻水逐饮功效，表明醋甘遂乙酸乙酯部位为其泻水逐饮活性部位[2]，但其功效成分仍待深入研究。醋甘遂较生品毒性降低，在癌性腹水模型大鼠上表现为“有故无殒”，但在正常动物上醋甘遂仍表现出一定的肝、胃、肠毒性，其毒性研究不可忽视[3]。模式动物斑马鱼较小鼠等哺乳类实验动物具有低成本、易于观察且重复性好等优点，相对于细胞又更能体现中医整体理论，近年来已被广泛应用于中药毒性研究[4]。故本實验拟分离醋甘遂泻水逐饮活性部位各成分群，采用模式生物斑马鱼的胚胎对各成分群进行急性毒性评价，同时结合UFLCQTOFMS对各成分群的化学成分进行定性分析，以期为揭示醋甘遂活性成分群泻水逐饮的物质基础提供一定的依据。endprint

1材料

11药材

甘遂药材（产地：陕西省宝鸡市眉县，生产批号20150415）购自陕西省宝鸡市眉县天源中草药开发有限公司。经南京中医药大学唐于平教授鉴定为大戟科植物甘遂E kansui的块根，符合《中国药典》2015年版项下标准。

12动物

斑马鱼成鱼（野生型AB品系）购于南京尧顺禹生物科技有限公司，约7月龄，体长（35±03） cm， 体质量（045±01） g。

13仪器与试剂

SHIMADZU LC20快速液相色谱仪；高分辨质谱系统：配有电喷雾离子源（ESI）的Triple TOFTM 5600質谱、Peak View SoftwareTM Version 12质谱分析软件（AB SCIEX公司）；万能粉碎机（天津泰斯特公司）；TC10KA型双杰电子天平；MS105DV型电子天平（METTLER TOLEDO，1/10 万）；DZF6050型真空干燥箱（上海煜南有限公司）；SZX41型体式显微镜（上海明兹精密仪器有限公司）；R200型旋转蒸发仪（Buchi公司）；KH500DB型数控超声波清洗器（江苏昆山禾创超声仪器有限公司）；智能生化培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）；人工海水（蒸馏水、NaCl 137 mmol·L-1，NaHCO3 42 mmol·L-1，KH2PO4 044 mmol·L-1，CaCl2 13 mmol·L-1，KCl 54 mmol·L-1，MgSO4 10 mmol·L-1，Na2HPO4 025 mmol·L-1）；乙腈、甲酸均为质谱纯（Merck公司），水为超纯水（Millipore纯水机自制）。

2方法

21样品的制备

211醋甘遂的制备取净甘遂适量，根据2015年版《中国药典》（四部）炮制通则项下醋炙法规定，加醋拌匀，闷透，待醋吸尽，炒锅加热至260 ℃左右，翻炒9 min至颜色加深，略有焦斑，微带醋香气，取出放凉，即得。每100 kg甘遂用醋30 kg。

212醋甘遂活性部位各成分群的制备取醋甘遂10 kg，粉碎过4号筛，加10倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h；残渣加10倍量的水回流提取2次，每次2 h；合并4次滤液，得醋甘遂复合提取物。采用等倍量的乙酸乙酯萃取醋甘遂复合提取物10次，合并萃取液并减压浓缩至干。采用减压硅胶柱层析法，以石油醚乙酸乙酯（100∶2，20个柱体积）洗脱得成分群A（VEKA）；石油醚乙酸乙酯（100∶15，8个柱体积；100∶18，2个柱体积）洗脱得成分群B（VEKB）；石油醚乙酸乙酯（100∶40，8个柱体积）洗脱得成分群C（VEKC）；甲醇洗脱得成分群D（VEKD）。回收溶剂，减压干燥至干。各成分群相对于原饮片的提取率分别为VEKA 055%，VEKB 021%，VEKC 032%，VEKD 155%。

22UFLCQTOFMS定性分析

221各成分群供试品溶液的制备按各成分群在原饮片中的提取率，分别称取各成分群适量（均相当于醋甘遂1 g）至10 mL量瓶中，加20%乙腈超声溶解后加溶剂稀释至刻度。13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，022 μm微孔滤膜滤过，即得。

222色谱条件Acquity UPLC BEH C18色谱柱（21 mm×100 mm，17 μm， Waters公司），流动相为01%甲酸水（A）乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，20%～80%B；20～36 min，80%～99%B；36～38 min，99%B；38～42 min，99%～20%B；42～45 min，20%B），柱温30 ℃，流速04 mL·min-1，进样量2 μL。

223质谱条件离子源为电喷雾离子源（ESI），正离子模式下采集数据，扫描范围m/z 50～1 500，采用动态背景扣除（DBS）和触发信息关联采集模式（IDA）扫描的方法。去溶剂温度（TEM）550 ℃，离子喷雾电压5 500 V，去簇电压（DP）100 V，一级碰撞电压（CE）10 V，二级碰撞电压（CE）35 V，气帘气276 kPa，辅助气379 kPa，雾化气379 kPa。

224数据采集与分析运用Peak View SoftwareTM Version 12软件中的XIC Manager功能，并对总离子流图进行背景扣除，对各成分群的甘遂特征性化合物进行初步筛查。利用Formula finder软件，获得的目标化合物的相对分子质量、同位素分布等众多性息以测定化合物的元素组成。在总结国内外文献信息的基础上，结合目标化合物的特征碎片及裂解规律，进一步对目标化合物进行分析与鉴定。

23斑马鱼毒性评价

231斑马鱼胚胎的繁殖及收集斑马鱼成鱼养殖与繁殖方法参照zebrafish book[5]。水温控制（290±10） ℃，光周期为14∶10（即光照14 h，黑暗10 h），饵料为新鲜丰年虾。收集斑马鱼胚胎前，以雌雄比为1∶2的比例将成体斑马鱼分离喂养1周，产卵前合并至特制容器中，放入氧气泵以及加热棒，以控制水温及水的含氧量。次日，取出成鱼，收集鱼卵，以新鲜的超纯水清洗数次以除去未受精死卵及粪便等杂物，随后放入人工海水中，于生化培养箱中培养24 h，培养箱温度为（290±10） ℃，选取健康发育的斑马鱼胚胎用于实验。

232预实验确定毒性范围实验采用静水实验法[6]，以96 h为1个试验周期，试验期间不换水。取健康斑马鱼胚胎，以10枚/孔置于24孔板中，各浓度设置3个平行组，1个空白对照组。醋甘遂活性部位各成分群采用人工海水溶解（均能溶于人工海水中），配制成不同浓度的一系列样品（各成分群样品浓度均为浸膏浓度），加入对应孔中，每孔2 mL，均置于恒温培养箱中孵育。给药后每隔24 h于体式显微镜下观察并记录斑马鱼胚胎的发育及死亡情况，4 d后得出各成分群96 h的全部死亡的最小浓度（LC100）和全部存活的最大浓度（LC0）。endprint

233LC50的测定依据各供试品预实验得出的LC100和LC0范围，按照几何级数梯度设9个实验浓度组及1个人工海水对照组。各浓度设3个平行组，1个空白对照组。给药后，每24 h观察不同药物浓度下鱼卵的孵化及死亡情况，发现死亡及时取出，并记录，至4 d后即实验周期结束，将数据进行统计与分析，计算醋甘遂活性部位各成分群对斑马鱼胚胎的半数致死浓度（LC50）。采用SPSS Statistics 200软件计算斑马鱼胚胎的半数致死浓度（LC50）。

3结果

31UFLCQTOFMS定性分析

UFLCQTOFMS法得到的醋甘遂活性部位各成分群正离子模式下的总离子流图见图1。通过正离子模式下一级质谱的母离子峰及二级质谱得到化合物准确相对分子质量及相对应的碎片峰信息，根据保留时间及国内外文献研究[716]对母离子峰进行归属，结合裂解规律最终推测出巨大戟烷型二萜类11个，假白榄烷型二萜类11个，见表1。成分群A检测出化合物1～4；B中检测出化合物1～10；C中检测出化合物3～5，7，9，11～19；D中检测出化合物20～22，各成分群的一级质谱信息及二级碎片信息见表2。

甘遂的特征性化学成分为萜类成分，其中以二萜类为主，可分为巨大戟烷型（ingenane type）和假白榄烷型（jatrophane type）2类母核的化合物，其碎片离子大多以分子离子失去1个或多个中性羧酸分子为主[7]。巨大戟烷型二萜类成分如3O（2′E，4′Zdecadienoyl）5Oacetylingenol，其分子离子峰为m/z 563[M+Na]+，失去1分子或多分子羧酸分子產生[M-HOAc+Na]+ （m/z 503），[M-C9H15COOH+Na]+ （m/z 395）和[M-HOAc-C9H15COOH+Na]+（m/z 335）等离子碎片。假白榄烷型二萜类成分如kansuinin D/D1，在其各级串联质谱中，m/z 734，674，554分别对应[M-HOAc+H]+，[M-2HOAc+H]+和[M-4HOAc+H]+。又如假白榄烷型二萜类成分kasuinin B/C，失去乙酰基、苯甲酰基以及CO，产生m/z 685，623，563，473等离子碎片。

32醋甘遂活性部位不同成分群对斑马鱼胚胎极性毒性预实验结果

醋甘遂活性部位各成分群在96 h对斑马鱼胚胎的LC0和LC100经预实验得到，见表3。

33醋甘遂活性部位不同成分群LC50的测定

各成分群对斑马鱼胚胎的LC50见表4，表明各成分群毒性：B>C>A>D，成分群D在一定剂量范围内未表现出毒性。

34醋甘遂活性部位不同成分群的量毒关系

以药液质量浓度（mg·L-1）为横坐标，斑马鱼胚胎的死亡率（%）为纵坐标绘制醋甘遂活性部位各成分群对斑马鱼胚胎的量毒关系图。结果表明，醋甘遂活性部位成分群A，B及C对斑马鱼胚胎的毒性均呈明显的量毒关系，见图2。

4讨论

甘遂作为峻下逐水之要药，始载于《神农本草经》下品，中医临床采用醋炙以降低其毒性，但毒效物质基础及作用机制研究的不完整性一直是制约其临床安全有效应用的重要因素之一。课题组前期研究表明，醋甘遂乙酸乙酯部位是其毒效部位[1718]，深入研究该活性部位有助于进一步理解醋甘遂“有故无殒”的作用机制。模式生物斑马鱼基因有着与人类基因高达87%的同源性[1920]，且相比于小鼠及细胞等传统实验手段，具有高通量、给药量少、低成本、易于观察且重复性好等优点，已逐渐发展成为一种适用于生物医学和毒理学的模型[2122]，近年来已被广泛应用于中药毒性研究中[2326]。斑马鱼为体外受精，单次产卵量大，与小鼠相比，实验数据量多，其结果也相对更加稳定、可靠，且胚胎发育透明，便于观察其在实验过程中的孵化及发育情况，因此本实验采用斑马鱼胚胎对醋甘遂活性部位各成分群所进行的LC50测定，对后期各成分群的毒性研究具有一定的指导意义。

作为近年来新兴的定性分析方法，UFLCQTOFMS因其高效的分离能力及精确的结构鉴定能力，已被广泛地应用于中药化学成分分析等研究中[27]，本研究中采用该方法对甘遂活性部位各成分群的化学成分进行定性研究，得到了各成分群相对较全面的化学成分信息。

本实验中观察到成分群B对斑马鱼胚胎的急性毒性明显大于成分群C，且毒性剂量范围明显小于成分群C，胚胎孵化明显迟缓，表现出卵黄囊吸收延迟、囊腔肿大、肝脏及胃腺肠道发育不良、心腔肿大、脊柱弯曲、血液循环减缓等症状，表明成分群B对于斑马鱼胚胎有明显的发育毒性。同时UFLCQTOFMS分析结果表明成分群B中主要含巨大戟烷型二萜类成分，成分群C中主要含假白榄烷型二萜类成分。文献研究表明，假白榄烷型二萜类成分的细胞毒性较巨大戟烷型二萜类成分更小[2830]，综合本实验结果，成分群B与C之间毒性的差异可能是由于所含二萜类成分的差异性所致。因此，本文推测假白榄烷型二萜类成分可能为醋甘遂中更为低毒的活性成分，这为进一步探究醋甘遂“有故无殒”的物质基础提供了依据，且为后续研究提供了思路。

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