不同宫颈病变组织中HPV分型及P16、Ki-67的表达

韩翠娜 邹 歌 李丹丹 陈 燕

华北理工大学附属医院妇产科 河北唐山 063000

不同宫颈病变组织中HPV分型及P16、Ki-67的表达

韩翠娜 邹 歌 李丹丹 陈 燕

华北理工大学附属医院妇产科 河北唐山 063000

①目的 讨论不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒(HPV)的基因分型及多肿瘤抑制基因(P16)、Ki-67的表达情况。②方法 收集2015年7月～2016年8月因液基细胞学检测异常或HPV感染就诊于我院的患者91例均行阴道镜检查及活检，包括低级别宫颈上皮内瘤变(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)组、 高级别宫颈上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesions,HSIL)组各31例，以及宫颈鳞癌组29例；选择同期32例慢性宫颈炎患者作为对照组。采用Cobas4800技术检测高危型HPV(HR-HPV)在不同宫颈病变组织中的感染情况，采用免疫组化技术检测不同宫颈组织中P16和Ki-67的表达强度。③结果 随着宫颈病变程度的增加，HR-HPV的感染率增高，HR-HPV在不同宫颈组织中的感染率差异显著(χ2=26.67，P<0.05)；入选患者中主要为单一HR-HPV感染，随着宫颈病变程度的增加，HR-HPV的多重感染率也增加，且不同宫颈病变组织间的多重感染率差异有统计学意义(χ2=15.934，P<0.05)。P16、Ki-67在不同宫颈组织中表达水平差异显著，均有统计学意义(P<0.05)，且其表达水平与宫颈病变程度密切相关，随着宫颈病变程度的增加，P16、Ki-67的表达水平和染色范围逐渐增加，经过Spearman相关分析，计算结果分别为γ=0.784、γ=0.840，双侧检验水准P<0.05。④结论 HR-HPV的感染率及P16、Ki-67的表达强度与宫颈病变程度密切相关，P16和 Ki-67 有望作为诊断宫颈病变程度的重要辅助指标。

宫颈病变 高危型HPV P16 Ki-67

宫颈癌是妇科常见的三大恶性肿瘤之一。近几年，随着社会经济的迅速发展，人们的思想观念也发生改变，导致性生活开放，如初次性生活年龄提前、多个性伴侣等致病因素的出现，进而使患有该病的人群平均年龄日趋年轻化，对广大女性的正常生活造成了巨大的影响。据相关的研究表明，该病的发生同高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)之间存在较为密切的关联，通过早期的检测可以预防HPV感染和该病毒所引起的癌前病变。宫颈癌的发生是一个连续动态发展的过程，与多种癌基因及抑癌基因的共同作用相关。P16是一种抑癌基因，其在宫颈病变及宫颈癌组织中的过度表达越来越引起人们的关注，Ki-67可判断细胞的增殖活性，本文着重研究不同宫颈病变组织中HPV的感染情况及不同宫颈病变组织中P16和Ki-67的表达强度，报告如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2015年7月～2016年8月因液基细胞学检测异常或HPV感染就诊于我院的患者，均行阴道镜检查及活检。入选的患者均有性生活史，年龄为20～70岁。入选患者分为观察组和对照组，其中观察组91例，包括低级别宫颈上皮内瘤变(LSIL)、高级别宫颈上皮内瘤变(HSIL)各31例以及宫颈鳞癌患者29例；选择同期32例慢性宫颈炎患者作为对照组。收集的宫颈组织标本经宫颈活检或手术所获取，全部患者均未进行过放疗或者是化疗。

1.2方法

1.2.1HR-HPV的检测 Cobas4800技术检测HR-HPV。

1.2.2应用免疫组织化学检测宫颈组织中P16、Ki-67蛋白的表达

1.2.2.1免疫组化方法 标本经4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,每份标本连续制做3张切片,1张切片进行病理形态学HE染色，另外2张切片分别进行 P16、Ki-67染色。免疫组化染色按SP法进行,严格按说明书操作。

1.2.2.2免疫组化染色结果判断标准 P16 阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于细胞核或细胞浆；Pl6的结果判定：综合颜色深度和阳性细胞数量的百分比来进行评估，参照下列标准进行评分：①依照染色的深浅度来进行评判:没有显著颜色表现的即为0分，颜色不深或者稍微强于背景颜色的即为1分，中度染色或者为黄色的即为2分，颜色很深或者为棕褐色即为3分；②依照阳性细胞所占总细胞数量的百分比进行评估:宫颈组织当中阳性细胞数量比重<10%的即为0分，占10%～25%即为1分，占26%～50%即为2分，占>50%即为3分。最后以两者计分的乘积作为判断标准：(-)0分 阴性；(+)1～4分 弱阳性；()5～8分 阳性；()9～12分 强阳性。

Ki-67阳性表达为细胞核内出现棕黄色颗粒，Ki-67根据阳性细胞数量的百分比来进行评估：宫颈组织当中阳性细胞数量比重小于5%的即为阴性(-)；比重占5%～25%的即为弱阳性(+)；比重占到26%～50%为阳性()；阳性细胞数大于50%为强阳性()。

1.3统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得到的实验相关数据进行处理，计数资料采用卡方检验(如果不满足该检验的要求则使用 Fisher法进行检测)，采用卡方分割的方法来进行两种不同样本间的相互检测。等级资料相关分析采用Spearman相关检验进行统计学相关分析，当P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同宫颈病变组织中HPV的感染情况 123例患者中发现HPV阳性者95例，HR-HPV感染率为77.24%，其对照组17例，HR-HPV的感染率为53.13%，LSIL组20例，感染率为64.52%，HSIL组29例，感染率为93.55%，宫颈鳞癌组29例，感染率为100.00%，随着宫颈病变程度的增加，HR-HPV的感染率增高，各组比较差异有统计学意义(χ2=26.67，P<0.05)，见表1。

表1 不同宫颈组织中HR-HPV的感染率比较(n,%)

2.2HR-HPV感染类型与宫颈病变的关系 123例患者中HR-HPV单一感染者83例，占总例数的67.48%，多重(双重及以上)感染12例，占总例数的9.76%，其中对照组、LSIL组、HSIL组及宫颈鳞癌组中的单一感染率分别为53.13%、61.29%、83.87%及72.41%；多重感染率分别为0、3.23%、9.68%及27.59%。HR-HPV的多重感染率在不同宫颈病变组织间的感染率差异有统计学意义(χ2=15.934，P<0.05)，由此可见，随着宫颈病变程度的增加，HR-HPV的多重感染率增加，考虑可能与HR-HPV各基因型之间的相互作用促进高级别宫颈上皮内病变及宫颈癌的发展有关,见表2。

表2 不同宫颈组织中单一及多重HPV感染情况(n,%)

2.3P16蛋白在不同宫颈组织中的表达 P16阳性表达为棕黄色颗粒分布于细胞核或细胞浆内，P16蛋白的免疫组化染色在对照组和LSIL中大部分为阴性表达，在HSIL组及宫颈鳞癌组中P16表达主要呈阳性和强阳性，见图1。经过卡方检验，得出对照组分别与LSIL组、HSIL组及宫颈鳞癌组比较差异显著，均有统计学意义(P<0.05)；LSIL组分别与HSIL组、宫颈鳞癌组进行比较差异显著，均有统计学意义(P<0.05)；HSIL级与宫颈鳞癌组进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)。随着宫颈病变程度的增加，P16的表达水平增加，经过Spearman相关分析，得出γ=0.784，双侧检验P<0.05，可见P16的表达强度和染色范围与宫颈病变程度密切相关，见表3。

图1 P16在不同宫颈组织中的表达及定位

2.4Ki-67在不同宫颈组织中的表达 在对照组和LSIL组中Ki-67为弱阳性表达，主要为宫颈上皮层下1/3的细胞核着棕黄色；在HSIL组、宫颈鳞癌组中主要为宫颈上皮层下2/3乃

至宫颈上皮全层细胞核着棕黄色，呈中度阳性乃至强阳性，其中宫颈早期浸润癌中可见到突破基底膜的点滴状浸润灶，见图2。经过卡方检验，得出对照组分别与LSIL组、HSIL组及宫颈鳞癌组进行比较，差异显著，均有统计学意义(P<0.05)；LSIL组分别与HSIL组、宫颈鳞癌组进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)；HSIL组与宫颈鳞癌组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Ki-67免疫组化染色随着宫颈病变程度的加重其表达水平逐渐增加，经过Spearman相关分析，计算得到γ=0.840，双侧检验P<0.05，由此可见，Ki-67的表达强度和染色范围与宫颈病变程度密切相关，见表4。

表3 不同宫颈病变组织中 P16 上皮细胞的表达

表4 不同宫颈病变组织中 Ki-67上皮细胞的表达

图2 Ki-67在不同宫颈组织中的表达及定位

3 讨论

宫颈癌是目前临床上常见的妇科恶性肿瘤，宫颈癌有一个较长的癌前病变期，绝大部分宫颈癌是由宫颈上皮内瘤变(CIN)即宫颈癌前病变逐渐发展形成的，宫颈上皮内瘤变发展为宫颈癌需要一个相当长的演变过程。目前认为，持续性的HR-HPV感染与宫颈高级别上皮内瘤变及宫颈癌的发生密切相关，目前已确定基因组全序列的有200多种亚型[1]，其中40余种亚型感染与生殖系统疾病有关，近20种亚型感染可诱发宫颈上皮内病变或宫颈癌[2]，尤其以HPV16、HPV18 感染最为常见。如果能够做到早期筛查，可以早期发现癌前病变，在CIN期如能及时治疗，可防止病情的发展，是防治宫颈癌发生的关键环节。本研究发现，随着宫颈病变程度的增加，HR-HPV的感染率增加，多重感染率也增加，考虑可能与HR-HPV各基因型之间的相互作用促进高级别宫颈上皮内病变及宫颈癌的发展有关，进而增加了宫颈癌的发病率。

近年来，随着实验室分子生物技术的进步，人们通过寻找和应用一些具有高度敏感性和特异性的细胞标志物来替代或辅助传统的单纯的以细胞形态学改变为标准的诊断方法。在CIN的发生和发展过程中有多种分子出现异常表达，如P16、Ki-67等。P16基因是一种新型的抑癌基因，最早是由美国学者Kamb报道的，有研究显示许多恶性肿瘤中存在P16基因的异常表达[3]。P16基因的表达水平在许多原发性肿瘤中发生改变, 如头颈部肿瘤、食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等均发现，P16蛋白在这些肿瘤组织中的阳性表达水平均较非肿瘤组织中的阳性表达水平低，并且发现P16基因的失活率较高。而在宫颈上皮内病变及宫颈癌病例中存在P16蛋白的高表达,且会随着宫颈上皮内病变及宫颈癌病情的发展而呈现逐渐升高的趋势，且与其抑癌基因的形象并不相符。有学者认为P16蛋白在宫颈癌中表达水平增加的原因可能与HPV感染有关[4]，因为宫颈癌患者90%以上伴有HPV感染，HPV病毒表达E7蛋白，E7蛋白与pRb蛋白结合并使之失活，失活的Rb基因可以反馈性的刺激P16蛋白的表达水平升高。Munoz等在对HR-HPV感染的宫颈癌研究中发现，P16蛋白的表达水平与HPVl6 /18表达呈正相关[5]，说明P16的过表达与HPV感染有关。本研究中P16蛋白在慢性宫颈炎组织中绝大多数呈阴性表达, 而在 CIN、宫颈鳞癌组织中主要呈阳性或强阳性表达, 随着宫颈病变程度的增加，P16蛋白的表达强度及染色范围也逐渐升高，与文献的报道一致[5,6]。经过Spearman相关分析，得出γ=0.784，双侧检验P<0.05，显示P16蛋白的表达强度和染色范围表达与宫颈病变发生、发展的机制存在密切关系。

Ki-67抗原是一种与细胞增殖相关的核抗原，已有研究表明其增值指数是提示宫颈病变程度的一个灵敏标记物，Kimura[7]等和Alameda[8]等的研究均发现Ki-67在LSIL组、HSIL组及宫颈浸润癌中的表达水平逐渐增强，且差异显著。齐思琴[9]等的研究显示，宫颈癌组织中Ki-67的表达明显增强，提示Ki-67的过表达可能与癌细胞的增殖程度紧密相关。在本次实验研究中， Ki-67在慢性宫颈炎组、LSIL组、HSIL组及宫颈鳞癌中其阳性表达率分别为21.86%、 83.87%、93.55%、100.00%，经过两两卡方检验，得出各组之间差异显著，均有统计学意义(P<0.05)。Ki-67免疫组化表达强度和染色范围随着宫颈病变程度的加重其强度逐渐增加，经过Spearman等级相关分析，结果显示Ki-67的表达强度和染色范围与宫颈病变程度呈正相关(γ=0.840，P<0.05)。

综上所述，HR-HPV、P16及Ki-67在宫颈上皮内病变及宫颈癌发生、发展的过程中起着重要作用，且三者的表达水平均与宫颈病变的程度密切相关，对预测宫颈病变有一定的临床参考价值，也为宫颈病变的早期诊断、治疗提供一条新路径。

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(2017-02-27 收稿)(库雪飞 编辑)

DetectionofHPVgeneandtheexpressionofP16andKi-67indifferentcervicallesions

HAN Cuina,ZOU Ge,LI Dandan,et al

(North China University of Science and Technology Affiliated to Hospital,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo explore the HPV genotypes and the expression of P16、Ki-67 in different cervical lesions.MethodsA total of 123 patients who underwent colposcopy and biopsy during July 2015 to August 2016 because of abnormal liquid based cytology or HPV (human papillomavirus) positive in the our hospital were entrolled in the study.They were divided into study group and the control group.The study dgroup included 31 cases of low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL)、31 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and 29 cases of cervical cancer.The infection of high risk HPV (HR-HPV) in different cervical lesions was detected by Cobas4800 technique method, and the expression of P16 and Ki-67 underwent immunuhisto-chemistry to detect the expression of the degree of cervical lesions, analysis of the expression of SCCA, P16 and Ki-67 in cervical lesions and their relationship with the degree of cervical lesions.ResultsWith the increased in the degree of cervical lesions, HR-HPV infection rate increased, the infection rate of HR-HPV in different cervical tissues was significantly different(χ2=26.67，P<0.05);The patients were mainly single HR-HPV infection rate also increased,and the difference of multiple infection rates among different cervical lesions was statistically significant (χ2=15.934，P<0.05).The expression intensity of P16 and Ki-67 was closely related to the severity of cervical intraepithelial neoplasia (intraepithelial neoplasia cervical, CIN), The expression level of P16、Ki-67 was statistically significant differences in different cervical tissues (P<0.05),and the expression level of the factors in the cervical tissue was closely related to the degree of cervical lesions, the correlation coefficients werer=0.784,r=0.840,P<0.05.ConclusionThe infection rate of HR-HPV and the expression intensity of P16 and Ki-67 are closely related to the degree of cervical lesions.P16 and Ki-67 are expected to be the important supplementary indicators for the diagnosis of cervical lesions.

Cervical lesions.HR-HPV.P16.Ki-67

R 713.4

A

2095-2694(2017)05-365-05

韩翠娜(1989-)，女，硕士研究生。研究方向：妇科肿瘤。

陈 燕。