HZ-31多孢木霉菌剂的初步研制及其对阔叶杂草的毒力作用

朱海霞，马永强，郭青云

(青海省农林科学院/农业部西宁作物有害生物科学观测实验站/青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

HZ-31多孢木霉菌剂的初步研制及其对阔叶杂草的毒力作用

朱海霞，马永强，郭青云*

(青海省农林科学院/农业部西宁作物有害生物科学观测实验站/青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

本研究选用具有高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31作为研究对象，进行菌剂的初步研制及其对阔叶杂草的毒力作用测定。通过载体和助剂的筛选，初步研制可湿性粉剂，并对其抗紫外作用、货架寿命以及对藜、猪秧秧的防效进行测定。结果表明，HZ-31最适载体为高岭土、几丁质和聚乙烯醇，这3种载体对HZ-31均有较好的抗紫外保护作用，载体对延长HZ-31的储存期效果较好，可明显增加在常温20 ℃条件下的货架寿命，低温保存效果更显著。菌株HZ-31可湿性粉剂对猪秧秧和藜2种阔叶杂草的盆栽除草效果显著高于单纯的发酵液。通过高效菌株HZ-31菌剂的研制，有望协调运用其他环境友好型防治技术，构建田间杂草生物防治技术体系。

多孢木霉HZ-31；菌剂研制；除草效果

当今，农田杂草控制还是以化学除草剂为主体。随着农业现代化水平的提高，全球范围内的除草剂使用量将继续增加，大量施用化学除草剂带来了环境污染危机。长残效除草剂的应用引起了残毒药害，导致下茬作物减产甚至土地退化，全世界已有100余种化学除草剂在30余个国家被禁用或取消登记。另外，全球已发现188种杂草的324个生物型对19类化学除草剂产生了抗药性，使得药效降低、用药量增加、成本提高，也更加重了污染。因此，市场需求开始面向广谱、高效、低毒的新型除草剂的研制，发展生物除草技术已逐渐成为全球的共识。HZ-31多孢木霉是本实验室从患病大刺儿菜根部分离筛选出的生防菌株，前期研究结果显示该菌株对藜、猪殃殃、野燕麦等杂草具有高效除草活性，对主栽作物作物春小麦、蚕豆、豌豆均无致病性，该菌株具有开发成为真菌除草剂的潜力。针对生防菌株储存期短且不稳定的特点，本研究拟通过筛选出对活体菌株安全、对环境友好的载体，研制微生物除草剂剂型，同时对剂型抗紫外作用、货架寿命及除草效果进行测定。研究开发出适宜田间防除藜、猪殃殃等主要杂草的微生物除草剂新剂型，以期协调运用其他环境友好型防治技术，构建田间杂草生物防治技术体系提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 供试载体和助剂

载体(高岭土、硅藻土、拉开粉、磷酸钾、几丁质、壳聚糖)、稳定剂(膨润土、轻质碳酸钙)、润湿剂(SDS)、分散剂(羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇)。

1.2 载体和助剂的筛选

将高岭土、硅藻土、磷酸钾、拉开粉、几丁质、壳聚糖和羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、膨润土、轻质碳酸钙、聚乙烯醇等载体和助剂，分别按2 %的比例加入菌株HZ-31对应的最适培养基。分别以200 μl的菌液(稀释106个/mL)涂平板，4～6 d之后观察菌落生长状况，确定其对菌株孢子萌发的影响。将8 mm的菌饼置于不同载体或助剂的培养基中，观察不同载体助剂对菌株生长状况的影响。

1.3 菌株HZ-31可湿性粉剂制备

将HZ-31菌粉与筛选出的适宜载体、助剂，按照50 %的载体、6 %的分散剂、1 %稳定剂和3 %的润湿剂的比例混合，将样品在研钵中初步磨细、混匀，然后于小型高速粉碎机中粉碎，制成可湿性粉剂。

1.4 载体抗紫外作用

将载体高岭土、几丁质和聚乙烯醇与菌粉混合后置于距紫外灯30 cm处照射，隔20 min取出，无菌水溶解后用移液枪取出200 μl涂平板。恒温箱中培养后统计菌落数量，以不加载体的菌粉为对照，测定载体对菌种抗紫外线保护效率。

1.5 货架寿命试验

将载体高岭土、几丁质和聚乙烯醇与菌粉混合后装入广口瓶中，分别在常温20和4 ℃条件下储存。每1个月测定含活菌量。测定时菌剂加灭菌水溶解，利用稀释平板法涂平板，以不加载体的菌粉为对照，记录测定值，测定载体对菌储存时间的影响。

1.6 HZ-31可湿性粉剂对藜和猪秧秧的防除效果

将农科院试验田间生长4～5叶期，叶色正常的藜、猪殃殃移栽于Φ=15 cm花盆中，于实验室内培养；将制备的HZ-31的可湿性粉剂溶解，分别将溶解后的可湿性粉剂和HZ-31菌株发酵液进行接种试验，用小喷壶喷雾接种到移栽的健康杂草植株上，至茎叶上流滴为度。以接种清水的植株作为空白对照。每处理设置3次重复。7 d后调查杂草发病程度，称鲜重，计算发病率、鲜重效、病情指数。

2 结果与分析

2.1 载体筛选

将所有载体按照2 %的比例分别加入对应最适培养基，取200 μl的菌种稀释液均匀涂平板，同时将8 mm直径的菌饼置于平板培养，测菌落直径。菌株HZ-31在含不同载体的培养基上，菌落数量及直径测量结果如表1。

表1 HZ-31在不同载体上菌落数量及直径记录

图1 载体对HZ-31的抗紫外保护作用Fig.1 uv protection of carrier to HZ-31

由表1看出，高岭土、几丁质和聚乙烯醇载体处理后，菌落萌发数量多且菌落生长较快，故选作HZ-31的载体。

2.2 菌株HZ-31可湿性粉剂制备

以高岭土、几丁质作为载体，聚乙烯醇作为分散剂，结合适量的膨润土作为稳定剂，SDS作为润湿剂，进行可湿性粉剂的制备。虽然SDS对菌落生长没有起到明显的促进作用(表1)，但在农药可湿性粉剂配制过程中，它不仅可以保证产品遇水时能够被快速润湿，而且能协助分散剂与原药粒子迅速结合，因此，本试验中选用SDS作为润湿剂。

将HZ-31菌粉与筛选出的适宜载体、助剂按照50 %的载体、6 %的分散剂、1 %稳定剂和3 %的润湿剂的比例混合，粉碎，再混合，制成可湿性粉剂。

2.3 载体抗紫外作用

合适的载体可以优化菌体生存的微环境，在自然状态下也可以吸收部分阳光紫外辐射，对菌体起到一定的保护作用。青海地处高原，室外紫外线强度大，菌剂使用时必须要有较强的抗紫外能力，所以筛选出可以增强菌种抗紫外能力的载体具有重要意义。

从图1可以看出，对照处理的活菌量在波长312 nm的紫外照射20 min 后急剧下降，而在紫外照射40 min 内，高岭土、几丁质和聚乙烯醇对HZ-31的保护效率在70 %以上。60 min后保护效率下降直至趋于平缓。在80 min后各载体对菌的保护效率均下降至60 %左右。筛选出的高岭土、几丁质和聚乙烯醇对HZ-31均有较好的抗紫外保护作用。

图2 载体对HZ-31颗粒剂架寿命的影响Fig.2 Effect of carriers on shelf life of HZ-31 granules

2.4 货架寿命

生防菌剂要应用到实际生产中，要求必须在长时间贮存后仍保存较高的活菌量和菌活性，而适宜载体助剂可以延长菌剂的储存，故载体助剂对菌剂的贮存能力的延长是判断载体品质的一项重要指标。将载体高岭土、几丁质和聚乙烯醇与菌粉混合后加灭菌水溶解，取106倍稀释液涂平板，以不加载体的颗粒剂为对照，测定载体对菌储存时间的影响。

从图2可以看出，在4 ℃保存条件下，加入载体后的活菌量一直高于对照。在20 ℃保存条件下，对照活菌量在4个月后迅速下降，后又趋于平稳，但载体处理下降趋势缓慢，储存5个月时，对照活菌量为1.53×103个/g，载体的活菌量3.94×105个/g。证明载体处理可明显增加HZ-31在常温20 ℃条件下的货架寿命。

2.5 HZ-31可湿性粉剂对藜和猪秧秧的防除效果

表2结果显示，接种后7 d，HZ-31可湿性粉剂对猪秧秧的发病率、鲜重效和病情指数分别是86.5、88.6、82.3，对藜的发病率、鲜重效和病情指数分别是73.0、64.7、68.4。菌株发酵液对猪秧秧和藜的发病率、鲜重效和病情指数分别是59.3、57.7、61.3和51.8、43.2、54.4。菌株HZ-31可湿性粉剂对猪秧秧和藜2种阔叶杂草的盆栽防效显著高于发酵液。

3 结 论

表2 HZ-31可湿性粉剂和发酵液对藜和猪秧秧的致病力比较

本研究以具有较强致病活性的生防菌株HZ-31作为研究对象，通过培养基皿内试验筛选法筛选出了HZ-31适合的载体为高岭土、几丁质和聚乙烯醇，这3种载体对HZ-31均有较好的抗紫外保护作用，且对延长HZ-31的储存期效果较好，可明显增加在常温20 ℃条件下的货架寿命，低温保存效果更显著。

将HZ-31菌粉与筛选出的适宜载体、助剂按照一定比例混合，初步制备了HZ-31可湿性粉剂，并进行盆栽除草试验。可湿性粉剂对猪秧秧和藜2种阔叶杂草的盆栽防效显著高于发酵液，说明载体可明显提高菌株除草效果。

4 讨 论

微生物除草剂的开发应用比化学农药的开发存在更大的难度，其药效受外界环境影响很大，选择合适的剂型及载体助剂保持菌剂的稳定性和侵染活力至关重要，是生物农药开发成功与否的关键[7-10]。通过高效菌株HZ-31菌剂的研制，有望协调运用其他环境友好型防治技术，构建田间杂草生物防治技术体系，从而有效替代部分高毒化学农药，缓解和减轻农业生产中长期和大量依赖化学除草剂施用所造成的能源和环境问题。

杂草生防菌应具备对靶标杂草强致病力的同时，又得保证其稳定性。由于微生物细胞本身的生理特性，不能有效解决生物细胞长期常温保存的技术瓶颈，使得发酵基质的固体剂型不能像化学除草剂一样长期贮藏，与化学除草剂相比处于劣势。因此，未来还需探索出一种具有更长货架期的剂型，延长其货架寿命，提高对不良环境的抵抗力，为该菌株大田应用奠定更坚实的基础。同时还需在加强不同微生物、微生物菌剂与减量除草剂复配，开发新型除草剂方面加大力度。

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(责任编辑 李山云)

DevelopmentofBiocontrolAgentofTrichodermapolysporumHZ-31andItsEffectonVirulenceofBroadleafWeeds

ZHU Hai-xia, MA Yong-qiang, GUO Qing-yun*

(Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining in Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province, Xining Qinghai 810016，China)

TrichodermapolysporumHZ-31 was selected as a high pathogenicity strain to weeds, the development of biocontrol agents ofTrichodermapolysporumHZ-31 and its effect on virulence of broadleaf weeds were studied.Proper carrier and auxiliary were screened, and wettable powder was developed as biological herbicide dosage forms. Their resistance to ultraviolet, shelf life and control effect on seedlings ofChenopodiumalbumandGaliumaparinewere also determined. The result showed that the optimal vectors of HZ-31 were identified as kaolin, chitin and the polyving alcohol, these 3 kinds of carriers showed good resistance to ultraviolet, carriers obviously extended the shelf-life of HZ-31 under the condition of 20℃, and the effect of low temperature preservation was more significant. The control effects of wettable powder of strain HZ-31 toChenopodiumalbumandGaliumaparinewere significantly higher than that of the pure fermented liquid.The development of biocontrol agent HZ-31 was expected to coordinate with environmental friendly control technology and set up a system of weeds biological control in the field.

TrichodermapolysporumHZ-31; Development of dosage forms; Control effect to weeds

1001-4829(2017)3-0606-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.022

S476

A

2016-07-20

国家自然科学基金(31560518)；中国科学院“西部之光”人才培养计划

朱海霞(1985-)，女，青海西宁人，副研究员，主要从事杂草生物防治研究，E-mail：zhuhaixia0101@163.com，*为通讯作者，郭青云，女，研究员，主要从事农田杂草治理研究，E-mail：guoqingyunqh@163.com。