不同发酵天数的芝芪菌质对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

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(1.南京晓庄学院食品科学学院,江苏省高校“特殊生物质废弃物资源化利用”重点建设实验室,江苏南京 211171;2.南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点室,江苏南京 210023)

不同发酵天数的芝芪菌质对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

阮鸣1,喻斌2,霍光明1,张李阳1,周红霞1

(1.南京晓庄学院食品科学学院,江苏省高校“特殊生物质废弃物资源化利用”重点建设实验室,江苏南京 211171;2.南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点室,江苏南京 210023)

为筛选较佳的芝芪菌质发酵时间,本实验通过小鼠碳粒廓清实验,鸡红细胞吞噬功能实验,小鼠血清溶血素、IgM和IgG的含量检测,以及小鼠脾淋巴细胞增殖实验,考察了不同发酵天数的芝芪菌质对免疫抑制小鼠非特异性和特异性免疫功能的影响。结果表明:发酵25、30 d的芝芪菌质具有显著的免疫增强功效(p<0.05,0.01;0.05),提示可有效增强免疫功能低下人群的机体免疫力。

赤芝,黄芪药渣,双向性固体发酵,小鼠,免疫功能

目前国内有多家药厂生产黄芪精口服液,每年约有500吨黄芪药渣作为废弃物待处理。中药渣如不能有效处理,会导致严重的资源浪费和环境污染,同时还会产生严重的二次污染[1]。黄芪药渣已被证实是有效的固体发酵基质,除了含有大量粗纤维外,还含有较多的中药有效活性成分和粗蛋白、粗脂肪、矿物质等营养素,仍具有较高的药用和营养价值,可通过双向性固体发酵技术进行再开发利用[2]。

芝芪菌质是将灵芝菌种接种于黄芪药渣中进行固体发酵得到的灵芝菌丝体与黄芪药渣的发酵复合体。一方面培养基中黄芪药渣的化学成分为灵芝真菌的生长提供营养,另一方面灵芝真菌的酶又可改变黄芪药渣的组织和成分,故具有双向性,亦称为双向性固体发酵技术[3]。在双向性固体发酵工艺中,发酵天数对发酵产物的成分及活性有重要影响[4-5]。灵芝和黄芪均为药食兼用型药材,并被大量研究证实可显著增加机体免疫功能[6-11]。课题组前期研究已证实芝芪菌质对鸡、鱼、虾具有显著的免疫促进作用,且免疫活性强于灵芝菌、黄芪药渣及两者发酵前的物理混合物[12-14]。

本文通过非特异性免疫和特异性免疫多项免疫指标筛选较佳发酵天数的芝芪菌质,为其增强人体抵抗力的功能性食品及药品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

KM雄性小鼠384只(18～22 g)、SD雄性大鼠8只(180～220 g) 上海杰思捷实验动物有限公司;芝芪菌质 南京晓庄学院药用菌物研究所制备;灵芝菌 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种编号:5.0616);黄芪药渣 江苏南星药业有限责任公司;注射用环磷酰胺 江苏盛迪医药有限公司(批号:15102825);匹多莫德片 赛诺菲(批号:140811);印度墨汁 Solarbio LIFE SCIENCES(No.1221F021);Na2CO3、甲醇、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、NaH2PO4、Na2HPO4国药集团化学试剂有限公司;0.9～1.1 mm玻璃熔点毛细管 上海曼贤实验仪器商行;瑞氏染液、20%绵羊红细胞悬液、RPMI-1640 培养基和台盼蓝 南京建成生物技术研究所;刀豆素A(Con A) 美国AMRESCO公司(批号:20151217);小鼠IgGELISA试剂盒、小鼠IgM ELISA试剂盒 欣博盛生物科技有限公司(Lot.M160809-116b,Lot.M160914-129a)。

SW-CJ-1F型超净工作台 苏州苏净公司;101A-2型电热鼓风干燥箱 常州市范军干燥设备有限公司;LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;SynergyH1型酶标仪 美国BIOTEK公司;IX71型荧光显微镜 日本奥林巴斯公司;MCO-5AC型CO2培养箱 日本三洋公司。

1.2实验方法

1.2.1 不同发酵天数芝芪菌质的制备 将黄芪药渣置于60 ℃电热鼓风干燥箱烘干,粉碎,过20目筛,混匀,调节含水量至55%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/2,120 ℃高压灭菌120 min,备用。取固体培养基干重量10%～15%的灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于25 ℃恒温发酵室培养,实验人员每天观察两次,待菌丝体长满瓶时记为0 d,数天后终止发酵。收集整瓶发酵产物冷冻干燥,得芝芪菌质。按不同发酵天数芝芪菌质取样G0、G5、G10、G15、G20、G25、G30(G0代表菌丝长满全瓶后0 d,G5代表菌丝长满全瓶后5 d,依次类推),粉碎,过200目筛,加0.1% CMC-Na配成芝芪菌质含量为20 g/L混悬液。

1.2.2 小鼠碳粒廓清实验分组方法 取KM雄性小鼠120只(18～22 g),随机分成10组,每组12 只:对照组(正常组)、模型(环磷酰胺)组、阳性(匹多莫德,0.32 g/kg)组、给药组7组(G0、G5、G10、G15、G20、G25、G30)。除对照组外,其它各组均采用环磷酰胺复制免疫抑制小鼠模型。

造模方法:实验第1～3 d腹腔注射环磷酰胺(80 mg/kg),1次/d,连续3 d。第6 d再以相同剂量强化一次。

给药方法:第1 d开始灌胃给药,0.2 mL/10 g/d给药,400 mg/kg,1次/d,连续给药7 d,第6 d晚禁食12 h后,第7 d上午最后1次给药,进行检测。

检测方法:每只鼠尾静脉注射5倍稀释的印度墨汁0.05 mL/10 g体重,分别于第2、12 min用毛细采血管在小鼠眼眶后静脉丛取血20 μL溶于2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,摇匀。以0.1% Na2CO3溶液作空白,于600 nm处测定吸光度。

检测指标:取小鼠肝、脾脏,称重。计算廓清指数K、校正廓清指数α。

K=(log OD1-log OD2)/(t2-t1)

α=K1/2×体重/(肝重+脾重)

注:OD1和OD2分别是第2、12 min的吸光度,t1和t2分别为2、12 min。

1.2.3 鸡红细胞吞噬功能实验 分组、造模、给药方法同1.2.2。

检测方法:最后一次给药后1 h,每只小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 mL。间隔30 min颈椎脱臼处死,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水1 mL,转动鼠板1 min。然后吸出腹腔液0.5 mL,平均分滴于2片玻片上,自然干燥,以甲醇溶液固定,加入瑞氏染液染色1 min,滴加pH6.5的PBS与染液混匀,静置5 min,纯净水冲去染料,干燥后镜下观察计数,计算吞噬百分率和吞噬指数[15]。

检测指标:吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100;

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞

1.2.4 对免疫抑制小鼠血清溶血素的影响 分组、造模、给药方法同1.2.2。

检测方法:给药7 d后,每鼠腹腔注射20%绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2 mL致敏,给药14 d后眼眶取血制备血清,用于溶血素的检测。将收集好的血清做系列稀释,确定最佳稀释度。吸取稀释的血清0.5 mL放入另一试管中,依次加入20% SRBC、10稀释补体、0.9%生理盐水各0.5 mL,空白管用生理盐水代替血清,混匀,置37 ℃温箱温1 h,然后置冰浴中5 min以终止反应,离心,取上清液于540 nm 处测定OD值,计算出溶血素含量。

检测指标:溶血素含量=样本血清的OD值×稀释倍数。

1.2.5 对免疫抑制小鼠血清IgM、IgG含量影响 分组、造模、给药方法同1.2.2。检测方法:采用ELISA法,按照说明书要求测定血清中IgG、IgM含量。

1.2.6 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 含药血清的制备:实验各组SD雄性大鼠连续灌胃给药(400 mg/kg)7 d后,颈动脉取血,制备含药血清。对照组和ConA组共用1只空白大鼠、其他给药7组分别用1只大鼠制备含药血清。

脾细胞原代培养:小鼠用75%乙醇浸泡5 min,无菌操作取脾脏,用完全RPMI-1640培养基制备2.0×106/mL的脾细胞悬液,台盼蓝染料检测细胞活力>95%以上,备用。

表1 碳粒廓清和鸡红细胞吞噬功能实验结果Table 1 The experimental results from carbon clearance and phagocytosis of chicken red blood cells(±s,n=10)

注:*p<0.05;**p<0.01。

表2 小鼠血清溶血素和IgM、IgG的含量检测Table 2 Determination of hemolysin,IgM and IgG in mice serum(±s,n=10)

注:*p<0.05;**p<0.01。实验方法:将各组100 μL脾细胞悬液分别加入96孔培养板中,再分别加入Con A(终浓度为5 μg/mL)及含药血清,总体积200 μL。设置只加200 μL RPMI-1640培养基为空白对照。

每实验组设10个复孔。加液后把培养板置于微量振荡器上振荡2 min混匀,于37 ℃含5% CO2培养箱中温育72 h,变色后用MTT法于酶标仪测吸光值A(λ=490 nm)。增殖指数SI=样品组A/ConA组A。

1.3数据统计分析

2 结果与分析

2.1非特异性免疫功能实验

根据表1可见,对照组各检测指标与模型组相比p<0.05,0.01,表明造模成功,即除对照组外其余各组都是免疫功能低下的小鼠。阳性组各检测指标与模型组相比p<0.05,0.01,表明匹多莫德片可有效提高免疫功能低下小鼠的机体免疫力。G25、G30两组芝芪菌质均可显著增加免疫抑制小鼠K值、α值、鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(与模型组比较,p<0.05,0.01;0.05),提示发酵25、30 d的芝芪菌质可显著提高免疫抑制小鼠的非特异免疫吞噬功能。但发酵5～20 d的芝芪菌质各项检测指标却未见显著增强(与模型组比较,p>0.05)。

2.2特异性免疫功能实验

由表2可以看出,对照组各检测指标与模型组相比p<0.01,表明造模成功。阳性组各检测指标与模型组相比p<0.05,0.01,表明阳性药有效(同表1)。G25、G30组均可显著增加免疫抑制小鼠血清中IgM和IgG含量(与模型组比较,p<0.05,0.01;0.05),其中G25组还可有效提高免疫抑制小鼠血清中溶血素水平(与模型组比较,p<0.05),提示发酵25、30 d的芝芪菌质均可显著提高免疫抑制小鼠的特异性体液免疫功能。

表3所列结果表明,对照组吸光值与ConA组相比,ConA可显著增加小鼠脾淋巴细胞增殖(p<0.01)。G25、G30组的吸光值均显著增加(与模型组比较,p<0.05),提示发酵25、30 d的芝芪菌质可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,可显著提高免疫抑制小鼠的特异性细胞免疫功能。

表3 小鼠脾淋巴细胞增殖实验的结果Table 3 The results from mouse spleenlymphocyte proliferation experiment(±s)

注:*p<0.05;**p<0.01。

3 讨论

从以上实验结果可以看出,发酵25、30 d的芝芪菌质均具有显著的特异性和非特异性免疫促进功效,说明在发酵初期,灵芝菌在不断吸收黄芪药渣中的营养成分、处于生长阶段,黄芪药渣中的有效成分也因酶的作用在变化,因此未体现出明显的免疫功效;当发酵天数达到25 d时,芝芪菌质基本达到了稳定状态,免疫增强活性也达到了最强;当发酵天数继续增加时,芝芪菌质的化学成分和免疫增强功能又发生了变化,因此发酵天数为30 d的芝芪菌质虽然具有免疫增强活性,但与发酵25 d的芝芪菌质相比(p<0.01),部分指标显著性略有不同(p<0.05)或无显著性(p>0.05);如果继续延长发酵时间,芝芪菌质会因水分的缺失而干枯,故本实验设计的最长发酵天数为30 d。

本课题组前期研究结果表明:黄芪药渣与灵芝菌经双向性固体发酵25 d后,黄芪药渣中的有效成分黄芪甲苷转变为异黄芪甲苷[16]。有学者证明在PHA刺激下,异黄芪甲苷和黄芪甲苷均能显著诱导产生IL-2活性,活性指数分别为 80.19%和66.10%,而对照组仅为51.11%;在LPS刺激下,异黄芪甲苷诱导产生IL-1B和IL-8能力强于黄芪甲苷[17]。IL-2是一种由T细胞激活的细胞因子,具有显著的免疫调节和抗肿瘤作用;IL-1B可激活T细胞和巨噬细胞,并有抗菌活性;IL-8也是一种常见的中性粒细胞趋化性细胞因子,可提高炎症应答。此外,在Con A诱导下,1 μg/mL异黄芪甲苷可明显刺激脾细胞增殖[18]。这些药效学研究结果均为黄芪药渣发酵后具有增效作用提供依据。本课题组前期还研究发现,芝芪菌质中多糖、蛋白质的含量在第25 d达发酵高峰,总皂苷含量在第20 d达发酵高峰[4]。已有的动物免疫实验结果表明,经过20～25 d发酵的芝芪菌质能明显增强AA肉鸡对新城疫、禽流感H9、H5的免疫力[19]。而其他学者将灵芝接种于雷公藤上,观察不同发酵时间所得菌质的化学成分、急性毒性和免疫功能的变化,结果发现发酵第30 d(G30)所得的菌质总二萜的含量最低,为0.57%;与雷公藤生药比较,G30的LD50最高,甚至G30所得菌质的体液免疫和细胞免疫抑制作用亦是最强[5]。以上研究结果表明不同发酵天数芝芪菌质中化学成分与动物免疫功能密切相关。

综上所述:双向性固体发酵往往伴随着化学成分的改变,故可实现增效、扩效等作用。但固体发酵产物的成分、药效与发酵时间密切相关,发酵时间的不同可引起芝芪菌质中某些效应成分含量的差异,后者又会导致芝芪菌质免疫促进活性的不同。本文通过免疫活性实验确定了较佳发酵天数的芝芪菌质,笔者随后将水提该菌质得其水提液,再经大孔树脂分离得到不同浓度的乙醇洗脱部位,并经动物实验确定免疫活性部位,最后在免疫活性部位中分离制备有效成分或有效成分群。

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Effectsofzhiqifungalsubstancefromdifferentfermentationtimeonimmunefunctionofimmunodeficiencymice

RUANMing1,YUBin2,HUOGuang-ming1,ZHANGLi-yang1,ZHOUHong-xia1

(1.Jiangsu Provincial Key Construction Laboratory of Special Biomass Waste Resource Utilization,School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation ofChinese Materia Medica,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

To screen the optimal fermentation time of Zhiqi fungal substance,effects of zhiqi fungal substance from different fermentation days on specific and nonspecific immune function of immunodeficiency mice were investigated by experiments of mouse carbon clearance,phagocytosis of chicken red blood cells,determination of hemolysin,IgM and IgG in mice serum,mouse spleen lymphocyte proliferation. The results indicated that zhiqi fungal substances after 25 and 30 days’ fermentation had both distinct immune-enhancing-effect(p<0.05,0.01;0.05),which hinted they could obviously strengthen immunocompromised population’s immunity.

Ganodermalucidum;Radixastragaliresidue;bidirectional solid fermentation;mouse;immune function

TS201.4

A

1002-0306(2017)19-0289-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.053

2017-03-24

阮鸣(1979-)，女，博士，讲师，研究方向：药食兼用食品的功能性研究及其化学成分的分析，E-mail：1169195814@qq.com。

江苏省自然科学基金项目(BK20150088，BK20151564)；国家自然科学基金面上项目(81573713)；江苏省高校重点建设实验室项目(苏教高[2016]8)。