地参酚类化合物对亚硝酸盐的清除作用

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(大理大学公共卫生学院,云南大理 671000)

地参酚类化合物对亚硝酸盐的清除作用

郭琦,高春燕*

(大理大学公共卫生学院,云南大理 671000)

采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法,以亚硝酸盐清除率为指标,测定地参酚类化合物在体外模拟胃液条件下对亚硝酸盐的清除作用。并采用福林酚法测定地参游离酚和不溶性细胞壁结合酚的酚含量。同时,对地参酚含量与亚硝酸盐的清除作用进行了相关性分析。结果表明,反应时间和提取液浓度与清除效果均呈良好的对数曲线关系,相关系数均大于0.88;游离酚的IC50值范围为0.0839～0.2427 mg/mL,结合酚的IC50值范围为0.1189～0.3131 mg/mL,说明游离酚对亚硝酸盐的清除能力显著强于结合酚;游离酚的IT50值的范围为9.3452～22.2861 min,结合酚的IT50值的范围为0.1110～0.4613 min,表明结合酚对亚硝酸盐的清除速率显著的快于游离酚。酚含量与清除亚硝酸盐的作用具有显著的正相关性(p<0.05)。与VC相比,当地参酚类化合物提取液浓度为10 mg/mL时,相当于1.5 mg/mL的VC对亚硝酸盐的清除作用,基本上都达到全部清除,说明地参酚类化合物对亚硝酸盐具有显著的清除作用。

地参,酚类化合物,亚硝酸盐,清除

地参(LycopuslucidusTurcz.),又名虫草参,系唇形科(Labiatae)泽兰属多年生草本植物。地参具有很高的营养及保健功效,是药食兼用的佳品,享有“植物珍品”、“山中之王”的美称,晒干后可入药,其功能与冬虫夏草相当[1]。地参资源丰富,主要分布在云南昆明、大理、丽江等少数民族地区,以大理地区分布最为广泛,且品质最优。地参中含有丰富的酚类、糖类、氨基酸等成分,具有很好的抗氧化、降血脂、降血糖等功效[2]。大量的研究表明[3-6],酚类化合物是良好的还原剂、金属离子螯合剂、单线态氧猝灭剂及供氢体,具有强的抗氧化活性。许多植物原料的酚含量和抗氧化活性已被报道,酚类化合物的含量可作为其抗氧化能力的重要指标[7],抗氧化活性和总酚含量之间的显著线性关系表明,在所测草药中酚类化合物是占主导地位的抗氧化成分[8-10]。

亚硝酸盐是一种强氧化剂,人体内若积累过量的亚硝酸盐,可将血红蛋白中的二价铁离子氧化成三价铁离子,使血红蛋白失去携氧能力,引起高铁血红蛋白症,导致亚硝酸盐中毒。此外,在体内,特别是在胃液中,胺类与亚硝酸盐可以形成致癌性很强的N-亚硝基化合物[11-13]。已有报道,多酚对亚硝酸盐具有一定的清除作用[14]。地参中含有多种酚类化合物,且具有显著的抗氧化活性,但有关地参酚类化合物对亚硝酸盐清除作用的研究尚未见报道。

本文以亚硝酸盐清除率为指标,研究了地参酚类化合物在体外模拟胃液条件下对亚硝酸盐的清除作用,旨在为地参的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

地参 分别于2016年11月16日(T1)、2016年12月15日(T2)和2017年1月14日(T3)采于云南省剑川县沙溪镇四联村(S1)和江尾村(S2),清洗后于烘箱中60 ℃烘干,粉碎,过60目筛,置于4 ℃冰箱储藏备用。

对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、Folin-酚试剂、甲醇、乙酸乙酯 均为分析纯。模拟胃液:称取2.0 g NaCl,加双蒸水溶解,移入1000 mL容量瓶,加入7 mL浓盐酸,双蒸水定容至刻度[15]。

RE-5298型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;Scientz-ND型系列真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;WFJ 2000型可见分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;恒温水浴箱 金坛市大地自动化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 地参酚类化合物的提取

1.2.1.1 游离酚(Free phenolics,FP)的提取 准确称取地参粉末20 g,加入200 mL 80%的甲醇于室温条件下超声波辅助提取10 min,抽滤,残渣加200 mL 80%的甲醇再提取2次,合并滤液,35 ℃旋转蒸发除去甲醇,剩余水相用6 mol/L HCl将pH调至1～2,然后乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯相,无水硫酸钠过滤,35 ℃旋转蒸发除去乙酸乙酯,剩余残留物冷冻干燥,得游离酚提取物。

1.2.1.2 不溶性细胞壁结合酚(Insoluble cell wall bound phenolics,ICP)的提取 游离酚提取后所得地参残渣加入120 mL 4 mol/L NaOH(含10 mmol/L EDTA 和1% 抗坏血酸),在氮气保护下室温振荡水解4 h。待水解完毕,用6 mol/L HCl将pH调至1～2,真空抽滤,滤液乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯相,35 ℃旋转蒸发除去乙酸乙酯,剩余残留物冷冻干燥,得不溶性细胞壁结合酚提取物。

1.2.2 地参提取物酚含量的测定 采用Folin-酚法测定[16],得没食子酸标准曲线方程为y=0.0965x+0.0974(0～6.4 μg/mL),相关系数为0.9917。样品中酚含量测定结果以没食子酸等量每毫克提取物表示(μg GAE/mg)。

1.2.3 清除率的测定 参照常丽新等[17]的方法,并稍作修改。将地参酚类化合物(FP、ICP)提取物均配制成10 mg/mL的储备液。在25 mL具塞试管中,分别加入不同浓度的地参酚类化合物提取物稀释液各0.1 mL,加入10 mL模拟胃液,超声增溶,37 ℃预热10 min,加入10.0 μg/mL亚硝酸钠(NaNO2)标准溶液1.5 mL,然后将混合物置于37 ℃水浴锅中避光反应一定时间;加入0.4%对氨基苯磺酸2 mL,摇匀静置5 min;再加入0.2%盐酸萘乙二胺显色剂1 mL,摇匀加水定容,静置15 min后,于548 nm处以1 cm比色皿用试剂空白作参比测各溶液的吸光度。按下式计算地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐的清除率。

清除率(%)=(A1-A2)/A1×100

式中:A1-未加地参酚类化合物吸光度值;A2-加地参酚类化合物吸光度值。

1.2.4 亚硝酸盐稳定性评定 分别取10 mL模拟胃液于25 mL具塞试管中,于37 ℃预热10 min,加入10.0 μg/mL NaNO2标准溶液1.5 mL,混匀,分别于37 ℃水浴中避光放置20、40、60、80、100、120 min,采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法,以试剂空白作参比测各溶液的吸光度值。

1.2.5 不同反应时间对亚硝酸盐清除作用的影响 将FP和ICP提取物分别配制成10 mg/mL的储备液,精密吸取0.5 mL,分别反应不同的时间(FP分别反应10、20、40、60、80、100、120 min,ICP分别反应1、3、5、10、15、20 min),测定其对亚硝酸盐的清除率。

1.2.6 提取液浓度对亚硝酸盐清除作用的影响 将FP和ICP提取物均配制成10 mg/mL的储备液,再于25 mL具塞试管中分别加入1、2、4、6、8、10 mg/mL的系列稀释液各0.1 mL,按照1.2.3中的方法,反应一定时间,测定其对亚硝酸盐的清除率。

1.2.7 VC对亚硝酸盐的清除作用 参照李玲等[18]的方法,并稍作修改。将VC配制成2.5 mg/mL的储备液,于25 mL具塞试管中分别加入0.25、0.5、1、1.5、2和2.5 mg/mL的系列稀释液各0.1 mL,反应20 min,测定其对亚硝酸盐的清除率。

2 结果与分析

2.1地参酚类化合物提取物的酚含量

地参不同采收期游离酚和不溶性细胞壁结合酚提取物的酚含量结果见表1。由表1可以看出,采收地和采收期对地参酚类化合物提取物酚含量的影响具有显著性的差异。就FP而言,S1采收的地参,其酚含量在T1和T2之间无显著性差异,在T3时显著性下降;S2采收的地参,随着采收期的延后酚含量呈上升趋势。就ICP而言,S1采收的地参,随着采收期的延后,酚含量呈现先降低后升高的变化趋势,而S2采收的地参呈现先升高后降低的趋势。酚类化合物的合成代谢途径中涉及多种酶,包括PAL、TAT、C4H、PPO等。已有报道,诱导子、低温应激[19]、辐照[20]、营养素缺乏[21]、受伤、农药[22]以及病毒、真菌和昆虫的攻击[23]都会改变酶的合成或者酶的活性,从而影响植物中酚类化合物的合成。地参中酚类化合物的变化证实了气候、栽培条件、采收期对酚类化合物合成与代谢的影响。

表1 地参酚类化合物提取物的酚含量(μg GAE/mg)Table 1 The phenolic content of phenolic compounds extractfrom Lycopus lucidus Turcz.(μg GAE/mg)

注:数据表示为平均值±标准差;同一行不同字母表示同一采收地不同采收期差异具有统计学意义(p<0.05)。

表2 反应时间对FP清除亚硝酸盐作用的影响Table 2 Nitrite scavenging rates of FP at different reaction time

注:数据表示为平均值±标准差;同一列不同字母表示同一采收地采收期不同反应时间差异具有统计学意义(p<0.05)。

表3 反应时间对ICP清除亚硝酸盐作用的影响Table 3 Nitrite scavenging rates of ICP at different reaction time

注:数据表示为平均值±标准差;同一列不同字母表示同一采收地采收期不同反应时间差异具有统计学意义(p<0.05)，表4、表5同。

2.2亚硝酸盐的稳定性

亚硝酸盐的稳定性结果见图1,不同反应时间吸光值差异无统计学意义(p>0.05),说明亚硝酸盐在模拟胃液中具有良好的稳定性,不会随着时间的延长而发生降解。

图1 亚硝酸盐在模拟胃液中随时间变化的趋势图Fig.1 The trend of nitrite with gastric juice over time

2.3反应时间对地参酚类化合物清除亚硝酸盐作用的影响

反应时间对地参酚类化合物清除亚硝酸盐作用的影响结果见表2和表3。结果显示,反应时间与地参酚类化合物提取物清除亚硝酸盐的作用效果呈良好的对数曲线关系,相关系数均大于0.9,从曲线方程看，地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐的清除作用在一定浓度范围内随反应时间的增加而显著升高,这是由于随着反应时间的增加,反应物分子之间碰撞的机率增大,但当达到一定的清除效果时,随着反应时间的进一步增加,清除效果趋于平缓,这可能是由于酚类化合物与亚硝酸盐之间的反应逐渐达到了相对饱和的状态。就FP而言,当反应时间达到120 min时,其对亚硝酸盐的清除率达到最大,为88.59%～91.98%;就ICP而言,当反应时间达到20 min时,其对亚硝酸盐的清除率最大,为93.77%～98.81%。

表4 提取液浓度对FP清除亚硝酸盐作用的影响Table 4 Nitrite scavenging rates of FP at different extract concentration

表5 提取液浓度对ICP清除亚硝酸盐作用的影响Table 5 Nitrite scavenging rates of ICP at different extract concentration

地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐的清除速率用IT50值表示,即清除率达到50%时所需的反应时间,IT50值越小,说明其清除亚硝酸盐的速率越快。FP的IT50值的范围为9.3452～22.2861 min,ICP的 IT50值的范围为0.1110～0.4613 min,表明ICP对亚硝酸盐的清除速率显著的快于FP。此外,同一采收地,不同采收期的地参酚类化合物提取物其IT50值不同,且同一采收期,不同采收地的地参酚类化合物提取物其IT50值也不同。地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐清除速率的不同可以归因于其酚含量和酚类化合物组成的差异。

2.4提取液浓度对地参酚类化合物清除亚硝酸盐作用的影响

提取液浓度对地参酚类化合物清除亚硝酸盐作用的影响结果见表4和表5。结果显示,和反应时间相同,提取液浓度与地参酚类化合物提取物清除亚硝酸盐的作用效果也呈良好的对数曲线关系,相关系数均大于0.88。当提取液浓度达到10 mg/mL时,FP和ICP对亚硝酸盐的清除率达到最大,分别为83.41%～91.00%和87.77%～97.16%。

地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐的清除能力用IC50值表示,即清除率达到50%时所需提取液浓度,IC50值越小,说明其清除亚硝酸盐的能力越强。FP的IC50值范围为0.0839～0.2427 mg/mL,ICP的IC50值范围为0.1189～0.3131 mg/mL,说明FP对亚硝酸盐的清除能力显著强于ICP。此外,同一采收地,不同采收期的地参酚类化合物提取物其IC50值不同,且同一采收期,不同采收地的地参酚类化合物提取物其IC50值也不同。地参酚类化合物提取物对亚硝酸盐清除能力的不同可以归因于其酚含量和酚类化合物组成的差异。

表6 维生素C对亚硝酸盐的清除作用Table 6 Nitrite scavenging effect of vitamin C

表7 酚含量与清除亚硝酸盐作用的相关性分析Table 7 Correlation analysis between phenolic content and nitrite scavenging effect

注:*表示相关显著性水平p<0.05;**表示相关显著性水平p<0.01。

2.5VC对亚硝酸盐的清除作用

VC对亚硝酸盐的清除作用见表6。结果显示,VC浓度与清除作用之间呈良好的对数曲线关系，y=33.167ln(x)+155.49,相关系数为0.928,表明VC对亚硝酸盐的清除作用在一定范围内随浓度的增加而显著增加,但当达到一定的清除效果时,随着反应时间的进一步增加,清除效果趋于平缓。VC对亚硝酸盐具有显著的清除作用,IC50值为0.0416 mg/mL,最高清除率可达99.76%。与VC相比,地参酚类化合物对亚硝酸盐的清除作用不及VC,但大体上讲,当地参酚类化合物提取液浓度为10 mg/mL时其清除率与1.5 mg/mL的VC接近,基本上达到了全部清除。

2.6相关性分析

将地参酚类化合物提取物酚含量与清除亚硝酸盐的作用进行了相关性分析,结果见表7。

由表7可以看出,除了在S2采收的T2样品中的ICP,不同采收期和采收地的地参FP与ICP的酚含量与清除亚硝酸盐的作用具有显著的正相关性,说明地参酚类化合物提取物中的酚类物质对其清除亚硝酸盐的作用具有显著的贡献。已有研究表明,绿茶等植物多酚具有清除亚硝酸盐和抑制亚硝胺形成的作用,且其抑制作用与体系中酚类化合物的含量密切相关[24-25],这与本研究的结果一致。酚类化合物在同一苯环上有若干个酚羟基,因其含酚性羟基而极易发生氧化、聚合、缩合等变化,所以具有较强的抗氧化能力[26],而亚硝酸盐是一种氧化剂,因此二者在一定条件下能够发生氧化还原反应,从而达到对亚硝酸盐的清除。地参酚类化合物可能通过其主要成分,也可能通过其各成分之间的协同作用,发挥其清除亚硝酸盐的作用。

3 结论

反应时间和提取液浓度对亚硝酸盐的清除作用具有显著的影响。实验结果表明,反应时间和提取液浓度与清除效果均呈良好的对数曲线关系;FP和ICP的最优反应时间分别为120 min和20 min;当提取液浓度为10 mg时,地参酚类化合物对亚硝酸盐的清除作用达到最大;FP对亚硝酸盐的清除速率低于ICP,但清除作用却强于ICP。

将地参酚类化合物提取物酚含量与清除亚硝酸盐的作用进行了相关性分析,结果表明酚含量与清除亚硝酸盐的作用具有显著的正相关性。

与VC相比,当地参酚类化合物提取液浓度为10 mg/mL时,相当于1.5 mg/mL的VC对亚硝酸盐的清除作用,基本上都达到全部清除。

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NitritescavengingeffectofphenoliccompoundsfromLycopuslucidusTurcz.

GUOQi,GAOChun-yan*

(College of Public Health,Dali University,Dali 671000,China)

The nitrite scavenging effect of phenolic compounds fromLycopuslucidusTurcz. under the condition of gastric juiceinvitrowas measured by aminobenzenesulfonic acid-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride spectrophotometric method and the nitrite scavenging rate was used as index. Additionally,the phenolic content of free phenolics(FP)and insoluble cell wall bound phenolics(ICP)was determined by Folin-Ciocalteus method. Meanwhile,the correlation analysis was established between phenolic content and nitrite scavenging effect. The results showed that good logarithmic curve relationships between the reaction time and extract concentration,and scavenging effect were observed,the correlation coefficient was greater than 0.88. The FP IC50was in the range of 0.0839～0.2427 mg/mL and ICP IC50was in the range of 0.1189～0.3131 mg/mL,indicating that FP on nitrite removal ability was stronger than ICP. And the FP IT50value was 9.34518～22.2861 min,while the ICP IT50value was 0.1110～0.4613 min,showeing that ICP was faster than FP on nitrite scavenging rate significantly. There was a significant positive correlation between phenol content and removal of nitrite(p<0.05). Compared with VC,the concentration of VCextracted by the local phenolic compound was 10 mg/mL,which was equivalent to the scavenging effect of 1.5 mg/mL on nitrite,and basically all were removed. In conclusion,the phenolic compounds had significant scavenging effect on nitrite.

LycopuslucidusTurcz.;phenolic compounds;nitrite;scavenging effect

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0057-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.011

2017-04-11

郭琦(1992-)，女，在读硕士研究生，研究方向：营养与慢性疾病，E-mail:ggfamily@163.com。

*通讯作者:高春燕(1981-)，女，博士，副教授，主要从事植源性食品资源开发与利用的研究，E-mail:gcyxixi@163.com。

国家自然科学基金项目(31301455)。