基于Caco-2细胞模型研究青黛配方分散片吸收机制

闵志强，蒋淼，石娅萍

基于Caco-2细胞模型研究青黛配方分散片吸收机制

闵志强，蒋淼，石娅萍

目的：探讨青黛跨膜吸收转运机制。方法：采用Caco-2细胞模型，进行双向转运实验，说明药物转运方式，并比较两种青黛区别，最后考察不同浓度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制剂维拉帕米、丙磺舒和酮康唑对青黛分散片与原剂型有效成分的转运量的影响。结果：固体分散技术可以促进青黛有效成分的跨膜转运，该转运为被动转运过程，转运吸收不受P-gp、MRP和CYP3A4影响。结论：固体分散技术可通过青黛溶解度促进其有效成分的吸收。

青黛；固体分散；Caco-2细胞模型；吸收机制

Caco-2细胞模型是目前最为成熟和应用最多的体外吸收模型，可用于快速评估新药的细胞渗透性、阐明药物转运的途径、评价提高膜通透性的方法等，成为药物吸收研究的有力工具[1]。青黛配方分散片是我们采用固体分散技术，将青黛制备成一种以分散片为剂型，拟在临床上作为中药配方颗粒使用的新型饮片。本论文采用Caco-2细胞模型研究青黛配方分散片转运特性，从细胞水平考察青黛配方分散片吸收机制，为证实固体分散技术提高能青黛吸收提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试药

Caco-2细胞株(美国ATCC公司)；青黛配方分散片，实验室自制；青黛饮片，四川江油恒源药业提供，批号120301； DMEM培养基、高灭活胎牛血清(Fetalbovineseurm)、非必须氨基酸、谷氨酰胺、青/链霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、DMSO。酮康唑胶囊(南京白敬宇制药有限公司,批号：H10900055)、盐酸维拉帕米片(广东华南药业集团,批号：H45010807)；丙磺舒(上海集成药厂，批号：140601)；HPLC所用有机溶剂均为色谱纯，其余为分析纯。

1.2 仪器

美国Agilent1100高效液相仪；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司);跨膜电阻仪(Millipore公司);电热恒温水箱;倒置显微镜；恒温摇床。

2 方法

2.1 Caco-2 细胞模型培养

将 Caco-2 细胞置于含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1万单位/mL青霉素-链霉素双抗液的 DMEM培养基中，在 37 ℃、5% CO2恒温培养箱环境下培养，隔天换液。当细胞生长至孔面积的 80%左右，用胰酶消化且传代。取对数生长期的细胞以 1×105/mL 的密度接种于 Transwell小室中，顶侧（AP）与底侧（BL）分别加 0.5、1.5 mL 培养基，隔天换液，7 d 后每天换液，培养至 21 d，对跨膜电阻、细胞形态、酶表达、标志物甘露醇跨膜通量参数进行检验，合格后进行下一步实验。

2.2 Caco-2细胞模型的评价

2.2.1 细胞跨膜电阻 通过测量单细胞层的跨膜电阻来评价Caco-2 细胞是否分化成完整的单层膜，一般而言TEER值大于500 Ω/cm2时即表明CACO-2 细胞完全分化。本试验中采用电位仪监测Caco-2细胞在聚碳酯膜上生长21天时的TEER。结果在21天时TEER值已达634.32 Ω/cm2（＞500）,，表明 Caco-2 细胞单层已形成，可以用于转运实验。

2.2.2 细胞形态学 用倒置显微镜观察Caco-2细胞培养21天时细胞单分子层的形态。结果Caco-2细胞培养21天后，细胞分化与极化基本完成，表明可用于转运试验。

2.2.3 酶（碱性磷酸酶AKP）表达 分别取AP和BL培养液，用AKP试剂盒，测其AKP活性。结果发现AP侧与 BL 侧的碱性磷酸酶活性比值接近 3∶1，表明两侧极化已形成。

2.2.4 跨膜通量 采用甘露醇作为标志物检测所培养细胞的完整性，细胞符合要求后即用于实验。将Caco-2细胞以前述培养方法培养于Millicell TM膜中,培养21天,待用。将3H-甘露醇用空白HBSS配制成0.5 U Ci/mL的溶液。取在Millicell TM系统中生长了21天的Caco-2细胞模型,向其APical(AP)侧加入甘露醇溶液0.5 ml,BasolateraKBL)侧加入pH7.4的空白HBSS2.0 ml,置于37 ℃的振荡水槽中,50 rpm振荡。培养2 h后,测定BL侧中透过的3H-甘露醇的含量,计算其透过百分率，若通透量小于0.5%/h,则表明已经形成紧密的细胞单分子层结果，结果21天的通透率实测值为0.17%。

2.3 HPLC测试色谱条件

色谱柱：ZORBAX Extend-C18(4.6×250 mm,5 μm)；检测波长：288 nm，流动相：甲醇:水（70:30），流速：1.0 mL．min-1，柱温为25 ℃。

供试品溶液的制备：吸取接收池中的样品溶液100 μL,于离心机中离心15 min(13000 r/min),取上清液10 μL进样。

2.4 双向转运实验

将青黛原饮片与分散片分别用DMSO超声溶解，并用HBSS液稀释为含靛玉红2.5 μg/ml、靛蓝50 μg/ml的药液，备用。取符合“2.1”项下条件的转运孔，在实验前用37 ℃预热的HBSS 液荡洗 3 次，最后 1 次在 37 ℃培养箱中温孵 30 min，吸去废液。在 AP 侧至 BL 侧的转运实验中，AP 侧加药液 0.5 mL，BL侧加空白HBSS液 1.5 mL，设置 3 个复孔；在BL 侧至 AP 侧的转运中，AP 侧加空白HBSS液0.5 mL，BL 侧加药液 1.5 mL，设置 3 个复孔。给药后将 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒温摇床中，分别于 15、30、45、60、75、90 min 从接收池内取样100 μL，同时用空白HBSS 液补足，HPLC检测。按照下列公式计算药物转运量、表观渗透系数、外排比率等参数

药物在各时间点的累积转运量(Qn)以下式表示，Qn=CnV+ ，其中,n为取样次数;V为接收池体积;c为样品浓度;Vi为每次取样体积。

表观渗透系数(apparentper meability coefficient,Papp)，Papp=Q/Act，式中,Papp是表观渗透系数(cm2/min);Q是透过的靛玉红/靛蓝总量(μg);A为扩散面积(cm2) ,本实验中A为1.12 cm2;c是开始时施药池中靛玉红/靛蓝浓度(μg/mL);t是总实验时间(min)。

外排比率（ER)：ER= Papp（B-A）/ Papp（A-B）。如该比值大于2，则表示药物在Caco-2细胞中的转运有方向性，有外排转运体参与。

2.5 细胞吸收影响因素及影响药物试验

将两种青黛药液分别在 37 ℃下与不同浓度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制剂维拉帕米、丙磺舒和酮康唑溶液混合, AP 侧加药液 0.5 mL，BL侧加空白HBSS液 1.5 mL，设置 3 个复孔，给药后将 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒温摇床中，分别于90 min从接收池内取样 100 μL，同时用空白HBSS 液补足，HPLC检测，观察以上三种抑制剂对青黛吸收的影响，以及两种青黛之间的区别。

2.6 数据统计

各药物组别不同时间段的Papp值均采用spss 19.0统计软件处理,并进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 双向转运实验结果

试验结果见表1及图1-2，由结果可见，靛蓝和靛玉红在两侧的吸收ER＜2，说明药物在Caco-2细胞中的转运没有方向性，属于被动转运；同时与原剂型相比，青黛分散片有效成分Papp有明显（p＜0.05,p＜0.01）增高，说明分散片剂型有助于吸收。

表1 双向运转实验结果（n=3）

3.2 细胞吸收影响因素及影响药物试验结果

结果见表2，可见不同浓度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制剂维拉帕米、丙磺舒和酮康唑对青黛分散片与原剂型有效成分的转运量无明显影响（p＞0.05），说明靛玉红、靛蓝不是这三种物质的底物,吸收不受这三种物质调节。

表2 影响药物试验结果（n=3）

4 讨论及结论

青黛作为一味典型的中药粉末饮片，因其主要成分均难溶于水，不宜入汤剂煎服；又因青黛饮片为固体团粒状粉末，质地疏松轻浮，极易飞扬，以药汤送服常引起呛咳，尤其是儿童无法服用。由于该药服用不方便，目前临床用法主要为水煎，利用率极低，疗效难以保证。为解决这一问题，使青黛既能在临床上得到正确应用，又方便患者服用，我们采用了固体分散技术，将青黛制备成配方分散片[2～4]，以分散片为剂型，在临床上作为中药配方颗粒使用，该技术已于2012年获得专利授权[5]。将分散片剂型用于配方颗粒，既保持了传统中药饮片性质，又符合中医临床用药要求，可随症加减。同时产品质量可控可测，崩解迅速，能提高药物吸收度。在前期，我们已经初步证实了青黛配方分散片可提高其有效成分的在体吸收[6]，本次实验准备进一步明确青黛配方分散片的促进吸收机制。根据实验结果可证实固体分散技术可以促进青黛有效成分的跨膜转运，同时推断青黛有效成分的跨膜转运是一个被动转运过程，吸收与P-gp、MRP和CYP3A4无关，因而可以通过增加其有效成分的溶解度和溶出来提高其生物利用度,所以证实了通过固体分散技术将青黛饮片制作为分散片剂型可提高其吸收是非常合理，极其有效的一种做法，值得推广。

[1] 马博,孙桂波,杨志宏,等. 肠上皮细胞模型不同培养条件的优化及适应性研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2011,17( 11) : 205

[2] 闵志强,叶英杰,张廷模,等.青黛不宜入汤剂的考证[J].四川中医,2010, 28 (1):52-54

[3] 叶英杰,闵志强,杨明,等.青黛分散片制备工艺研究[J].中药药理与临床,2010,1(2):29-31

[4] 闵志强.青黛配方分散片研究[D].博士学位论文,成都中医药大学,2010年

[5] 闵志强,张廷模.一种青黛饮片及其制备方法[P].专利号:ZL 2010 1 0551085.4

[6] 闵志强,陈科,李亚丽,等.青黛配方分散片对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用及大鼠原位灌注试验[J].中药药理与临床, 2010, 26 (4):38-40

(责任编辑：傅舒)

Study on the absorption mechanism of Qingdai formula dispersible tablets based on Caco-2 cell/

MIN Zhi-qiang, JANG Miao, SHI Ya-ping//(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To explore the absorption mechanism of Qingdai.Method:Two-way transport experiments were conducted using Caco-2 cell model to explore drug transport way, and compare the difference between two kinds of Qingdai.Then, the influence of different concentrations of P-gp, MRP and CYP3A4 inhibitor verapamil, probenecid and ketoconazole on the transport of effective components of Qingdai dispersion tablets and the original formulation were investigated.Result:Solid dispersion technology can promote the transmembrane transport of effective components of Qingdai. The transport was passive transport which was not affected by P-gp, MRP and CYP3A4.Conclusion:Solid dispersion technology can promote the absorption of active ingredients of Qingdaiby increasing the solubility.

Qingdai; solid dispersion; Caco-2 cell model; absorption mechanism

R 283.3

A

1674-926X(2017)03-012-03

四川省教育厅资助科研项目 利用固体分散技术提高青黛饮片药效及吸收机制研究 编号14ZB0098

成都中医药大学药学院，成都 611137;

闵志强（1979-），男（汉），讲师，博士，主要从事中药药性理论与临床应用

Tel:13880641950 Email:minzq@qq.com

石娅萍（1978-），女（汉），讲师，博士，主要从事中药安全性评价

Tel:18982260169 Email:stone78520@163.com

2016-12-05