猪旋毛虫病诊断方法研究进展

2017-10-18庄金秋梅建国姚春阳

猪业科学 2017年9期

关键词：抗原兽医抗体

庄金秋，梅建国，张颖，姚春阳，李峰

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪旋毛虫病诊断方法研究进展

庄金秋，梅建国，张颖，姚春阳，李峰

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

栏目协办

猪旋毛虫病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。猪旋毛虫对于肉品卫生影响严重，是我国肉品首检和必检项目。文章从病原学、血清学和分子生物学方面概述了猪旋毛虫病最新诊断方法，以期为肉品检疫人员、广大养殖业主及兽医科研工作者更好地诊断和防治该病提供参考。

旋毛虫；猪旋毛虫病；诊断；检测；研究进展

猪旋毛虫病（Trichinellosis）是由毛首目毛形科（Trichinenidae）的旋毛形线虫（Trichinella spiralis）成虫寄生于猪的小肠，幼虫寄生于横纹肌而引起的严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。猪是人感染旋毛虫病的重要来源之一，人主要因食用生的或未煮熟含有活的旋毛虫幼虫的肉品而感染。本病分布于世界各地，对人类健康造成很大威胁，同时对养猪业、肉食品加工业、外贸出口业也造成了巨大的经济损失，是我国肉品首检和必检项目，欧盟也规定在其成员国内饲养的生猪必须进行旋毛虫检查。旋毛虫感染猪后几乎不表现任何临床症状，对于本病的临床诊断较为困难，且易与其他相似传染性疾病相混淆。国际贸易全球化也增加了猪旋毛虫病的传播机会。为更好地防控本病的发生，寻求早期、快速、高效和准确的旋毛虫病诊断方法已成为人们研究的热点。本文综述了猪旋毛虫病的诊断方法研究进展，以期为肉品检疫人员、广大养殖业主及兽医科研工作者更好地诊断和防治该病提供参考。

1 病原学诊断方法

1.1 压片镜检法

压片镜检法（TSM）是将屠宰后的生猪，取膈肌进行压片镜检，该方法是最简单的直观检查法。压片镜检法包括两种方法，一种是将一小块肌肉（0.5 g）置于两张载玻片之间挤压后（或两端用线扎紧），在普通光学显微镜的低倍镜下按顺序检查，也称为肌肉压片镜检法或显微镜检查法（简称镜检法），国内常用此种方法；另一种是通过专用的旋毛虫镜进行检查，其基本操作步骤是先将肉样置于两块特制的玻璃板之间，挤压后用螺丝固定，然后用旋毛虫镜进行检查，由于旋毛虫镜是将观察视野投放到屏幕上观察，一次可同时观察24个肉样，此方法在欧美国家常用。压片镜检法有存在漏检的可能，尤其对肌肉不成囊的伪旋毛虫检出率较低，并且可能由于人员操作不当和待检样品处理不善造成二次污染而感染人类和其他动物。压片镜检法也不能对活体动物或人类取用旋毛虫肌幼虫好发部位如膈肌进行检验。

1.2 集样消化法

集样消化法（BDM）又称人工消化法，是除去脂肪及结缔组织后利用胃蛋白酶将肌肉组织消化，从而使活的旋毛虫幼虫从囊包中释放出来，收集到的旋毛虫放在50～70倍显微镜下检查。集样消化法中的磁力搅拌法是目前公认的旋毛虫检验的金标准。于连富等[1]提出了适用于冷冻猪肉中旋毛虫体检测的改进消化法。尽管集样消化法经过不断改进其灵敏性较镜检法稍高，但在消化过程中受到很多因素的影响，而且集样消化法也大多用于对猪肉或人尸体的旋毛虫检查。

2 血清学诊断方法

2.1 凝集试验

目前可用于猪旋毛虫病检测的凝集试验有：皂土絮状凝集试验（BFT），胶乳凝集试验（LAT）和间接血凝试验（IHA）等。窦兰清等[2]应用微量IHA诊断70头人工感染猪旋毛虫病的病猪，取得了较为满意的结果。杨书军等[3]应用玻板IHA法快速现地诊断2 116头商品猪旋毛虫病。王绍基等[4]也采用IHA检测感染旋毛虫病豚鼠血清。殷礼等[5]以羧化聚苯乙烯胶乳作免疫载体，建立了LAT方法取得了比较满意的结果。郑星道等[6]用LAT法、TSM法和BDM法3种方法检测猪旋毛虫病，发现LAT法比后2种方法检出率高。郭成留等[7]以旋毛虫可溶性抗原作诊断抗原，聚苯乙烯微球为抗原载体，通过碳化二亚胺反应把旋毛虫抗原共价偶联到聚苯乙烯载体微球上，制备了用于检测猪旋毛虫病血清抗体的免疫微球诊断试剂。在检测的敏感性上，免疫微球凝集试验比人工消化检查法高9.17%，比压片镜检法高25.26%。Eissa等[8]应用协同凝集试验（CoA），对旋毛虫感染实验小鼠尿样和血样进行检测，均检到旋毛虫抗原。凝集试验适用于肉食品部门宰前检验和猪旋毛虫病流行病学调查。

2.2 间接荧光抗体试验

朱兴全等[9]在建立间接荧光抗体试验（IFAT）方法的基础上，对采自甘肃及河南的1 199份屠宰猪血清进行了猪旋毛虫病的血清流行病学调查。200份非疫区猪血清，IFAT有7份阳性，阳性率3.5%。999份疫区屠宰猪血清，IFAT检出阳性血清203份，阳性率20.32%，用人工胃液消化法检出有虫者185份，阳性率18.52%。2种方法阳性检出率无显著性差异。IFAT方法比较敏感，并有很高的特异性，但需配备荧光显微镜，因此应用受到限制。

2.3 沉淀试验

用于检测旋毛虫病的沉淀试验，包括环状沉淀试验、琼脂双扩散、免疫电泳等方法。Lilkova等[10]用双向电泳检测旋毛虫病猪血清中的抗原成分，结果在感染后30～120 d检测结果均呈阳性。Smith等[11]用双向对流免疫电泳检测旋毛虫感染小鼠血清中循环抗原和抗体，在感染后12 d就有抗原检出。沉淀试验敏感性有限，特异性也不是很强，并且对试验条件也有较高的要求，故现在已经很少应用此方法来检测猪旋毛虫病。

2.4 免疫酶染色试验

王彦平等[12]用人工感染旋毛虫的鼠和猪肌肉石蜡切片作抗原，用免疫酶染色试验（IEST）诊断人和猪的旋毛虫病均取得了很好的效果。朱名胜等[13]用IEST和斑点酶联（Dot-ELISA）方法检测感染旋毛虫的豚鼠血清的特异性抗体，结果二者呈现较好的一致性。IEST法具有较高的灵敏度和特异性，操作方便，不需要特殊仪器，且抗原片可长期保存研究，为一种实用性强、有发展前景的方法。

2.5 酶联免疫吸附试验

旋毛虫病是第一个应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法进行诊断的蠕虫病。ELISA法是目前检测猪旋毛虫病最敏感、最常用的方法，已被广泛应用于猪血清和肉汁样品检测。Ruitenberg等[14]最先将ELISA用于猪旋毛虫病的检测。Gamble等[15]首次用旋毛虫肌幼虫新陈代谢释放的排泄分泌物抗原（ES）建立ELISA方法来诊断旋毛虫病。我国张建安等[16]率先用ELISA方法检测猪旋毛虫。牛炳亨等[17]应用建立的ELISA方法对猪旋毛虫病人工感染及流行区现地猪血清IgG抗体进行检测，取得了较为满意的结果。邵华斌等[18]应用IHA与Dot-ELISA方法诊断猪旋毛虫病。宗粤琦等[19]分别以旋毛虫幼虫粗抗原、表面抗原、S3抗原作包被抗原建立ELISA方法，在家兔感染后第7天均检出了特异性抗体。张月清等[20]使用改良ELISA法（SPAELISA），将检测时间缩短为20 min。乔寿齐等[21]采用建立的快速ELISA法对从内蒙、河北、辽宁、吉林、山东、河南、北京、天津8省市屠宰的猪只随意抽样进行了猪旋毛虫抗体检测，阳性率在0.35%～1.08%之间。宋明忻等[22]应用单克隆抗体（McAb）快速ELISA诊断盒对感染了旋毛虫的猪定期检测其血清中抗体出现情况。结果在感染24 d后可在猪血清中检出抗体。许应天等[23]用Dot-ELISA法检测旋毛虫病犬血清中的特异性抗体，并与TSM和琼脂扩散试验（AGP）进行了比较。该法的检出率比AGP高15.92%，比TSM高18.37%。黄爱民等[24]采用镜检、集样消化和ELISA法3种方法对2001—2003年共采集的9 196份肉样和9 003份血清样品进行检测，3种检测方法检测结果有较大的差异。陈晓英等[25]采用ELISA法调查了拉萨市、墨竹工卡、工布江达及林芝县等地12个乡镇藏猪的前腔静脉血样1 440份，旋毛虫的平均感染率为1.18%。吴秀萍等[26]采用ELISA检测试验猪感染旋毛虫2个月内不同天数的血清抗旋毛虫IgM和IgG抗体水平，表明肠道期肌幼虫、成虫和肌幼虫的ES抗原可用于检测旋毛虫的早期感染，成虫和肌幼虫的ES抗原可用于检测出栏猪的旋毛虫感染。蔡海松等[27]、陈春花等[28]、何光志等[29]先后以纯化的融合蛋白p49/GST、重组抗原（TSRA）和Ts88为包被抗原，建立了检测猪旋毛虫抗体的间接ELISA方法，显示出较好的优势。

2.6 胶体金免疫层析试纸条法

用试纸条诊断猪旋毛虫病，特异性高，敏感性强，方法简便，快速实用。温艳等[30]用建立的胶体金一步法快诊试纸条检测感染旋毛虫猪的血清及正常血清。杨俊兴[31]用15 nm胶体金颗粒标记抗旋毛虫ES抗原单克隆抗体及旋毛虫人工ES抗原，分别制成了检测ES抗原和检测抗体的猪旋毛虫病快速诊断试纸条。邓瑞广等[32]分别采用快速试纸条法、快速ELISA法、常规镜检法和人工胃液消化法4种方法检测1 566头屠宰猪的猪旋毛虫病。结果旋毛虫检出率分别为1.66%、1.66%、1.21%和1.60%，结果与ELISA方法相一致。李雁萍[33]制备的免疫层析试纸条更适合检测肉汁中的旋毛虫抗体。于海波[34]应用胶体金标记单克隆抗体A11和B13，将其制成试纸条并进行大量检测，达到了预期效果。

3 分子生物学诊断方法

血清学方法可以用来对猪旋毛虫病监测和流行病学进行研究，但这些方法大多是用已知抗原来检测待测抗体。然而，有时抗体的存在并不总与肌幼虫出现的步调相一致。为了克服传统的血清学方法的局限性，一些分子生物学技术，如常规PCR、随机扩增多态性DNA（RAPD）、PCR构象多态性分析、PCR限制性片段长度多态性、多重PCR及实时荧光定量PCR等相继已被开发用于检测和诊断旋毛虫感染。Caballero-Garcia等[35]用PCR方法对实验感染小鼠进行旋毛虫病早期诊断，结果最早在感染后第3天检测到旋毛虫DNA。Tighe等[36]用RAPD技术对旋毛虫基因组DNA进行分析，发现不同的旋毛虫虫株可得到不同的DNA扩增区带。杨鹏欣等[37]以旋毛虫的18sRNA基因为靶序列，建立了双重PCR的液相基因芯片检测方法。张子群等[38]用旋毛虫隔离体线粒体LS-rRNA基因作为靶序列，设计合成引物和Taq man MGB探针应用于对旋毛虫的通用检测。由于旋毛虫本身及其在宿主体内寄生部位的特殊性，使得难以在生前从被感染动物的血液及其他组织或排泄物中扩增到旋毛虫DNA，因而用PCR等基因检测技术对旋毛虫病的生前检测受到了限制。

4 小结

我国是世界上受旋毛虫病危害最为严重的少数几个国家之一。我国养猪业正迅猛发展，人们对猪肉及肉制品的质量要求也越来越高。旋毛虫病对于肉品卫生影响严重，因此，控制和消灭猪旋毛虫病显得非常重要。随着免疫学和分子生物学技术的不断发展，以及在寄生虫研究领域广泛应用，猪旋毛虫的诊断取得了较大进展，这对当前控制猪旋毛虫病的感染提供了有效手段，但这些方法在操作程序上和适应性方面还存在一定的不足。随着人们对旋毛虫抗原研究的深入及现代生物学技术的发展，相信不久的将来具有较高的敏感性、特异性和稳定性，又简便经济、适用性广的诊断方法将会建立起来，对有效控制旋毛虫病流行和进行肉类和肉制品卫生监督，保障食品安全将发挥重要作用。

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