免疫学技术在奶牛妊娠检查中的应用

李晓林，刘长彬,2

（1.石河子大学，石河子 832003；2.新疆农垦科学院，石河子 832003）

免疫学技术在奶牛妊娠检查中的应用

李晓林1，刘长彬1,2

（1.石河子大学，石河子 832003；2.新疆农垦科学院，石河子 832003）

随着规模化牛场养殖集约化程度的加深，妊娠检查要求在30d之前达到高准确率，但现在的早期妊娠诊断方法明显达不到要求。本文重点从免疫学方法入手，比较了不同方法针对不同内源物质在早期妊娠诊断上的技术难度、繁琐程度、成本、精确程度，以期为后续早期妊娠诊断发展和研究提供方向。

奶牛；免疫学；早期妊娠诊断

目前，情期人工授精的受孕率头胎奶牛为60%左右，而经产奶牛仅有50%。未妊娠奶牛如不能及时检出，就会导致繁殖周期的紊乱和产奶量的降低，直接影响经济效益[1]。故对配种后母牛及时观察，或借助仪器和实验室手段进行早期妊娠诊断在奶牛生产中有着非常重要的意义[2]。早期妊娠诊断具有两方面作用：①确诊已妊娠母畜，进而加强饲养管理，保证胎儿正常发育；②检出未妊娠母畜，找出未孕原因，采取措施使其及时进入下一个情期，从而有效地提高母畜繁殖效率和减少经济损失[3]。

国内目前对牛的早期妊娠诊断方法开展了大量研究。临床上主要对孕体，包括胎儿、胎膜和胎水的存在与否及存在状态进行检查[4]，主要采用的方法是直肠检查和超声波检查。直肠检查需要兽医有丰富、长期的基层工作经验，同时奶牛配后第一个情期即使通过尿膜羊膜囊触摸法在30d之前也很难检查出来[5]。超声波检查随着技术的改进和方法的革新，在规模化牛场应用广泛[6]。但是由于配后18～21d，B超还不能捕捉到可信度高的胎儿发育信号，故临床上用于早期妊娠诊断的效果并不理想[7]。

奶牛妊娠实验室诊断是依据从孕体、子宫、卵巢进入母体血液、尿液或乳汁的妊娠相关物质含量来检测奶牛是否怀孕，这些物质包括孕马血清促性腺激素（PMSG）、早孕因子(EPF)等特有妊娠因子和孕酮（P4）及硫酸雌铜等能产生变化的物质[8]。对家畜进行早期妊娠诊断的实验室方法较多，如放射免疫测定法、胶体金免疫检测技术、酶免疫测定法等[9]。这些方法均应用了免疫学的原理和方法。

1 免疫学方法早期妊娠诊断的主要内源物质

1．1 孕酮

奶牛妊娠后的第1个情期（21d）内，由于黄体的持续存在，孕酮水平相对于未妊娠牛较高[10]。孕酮在早期妊娠诊断中应用最广泛。其来源于血液和乳汁中，由于乳汁中孕酮含量高于血液，同时也便于收集[11]，故乳汁中孕酮含量测定常作为判断奶牛是否怀孕的依据。

1．2 糖蛋白

妊娠母牛胎盘滋养层双核细胞可表达妊娠相关糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins, PAG）[12]。奶牛妊娠后，外周血液PAG浓度开始缓慢上升，妊娠22d可达2ng/mL以上，明显高于未妊娠牛（低于0.2ng/mL），妊娠28d时最高可达5.4ng/mL[13]。这一生理特点为奶牛早期妊娠诊断提供了理论依据。奶牛外周血液PAG浓度检测主要采用放射免疫测定法和酶联免疫吸附试验。其中放射性免疫法测定PAG的灵敏度已达0.2ng/mL。通过PAG进行早期妊娠诊断，奶牛人工授精28d后可取得90%以上的妊娠诊断准确率[14]。但妊娠相关糖蛋白检测法需要的实验室条件比较严格，检测成本和技术要求都要求较高，同时也仅在奶牛受精28d后较超声波和直肠检查准确率高。

1．3 早孕因子

早孕因子（early pregnancy factor, EPF），亦称免疫抑制性早孕因子和早期妊娠因子，是一种存在于牛乳和血清中的妊娠依赖性多分子蛋白复合物。在妊娠初期，早孕因子为抑制母体的细胞免疫而使胎儿免受免疫排斥而出现，接着在胎儿死亡或流产后很短时间内便会消失，所以可以作为妊娠后胎儿存活的指示因子[15]。奶牛在受精24h后，血清和乳中可检测到EPF，一旦妊娠终止，EPF立即消失[16]。李青旺等研究表明，奶牛配种后31～50d内是最佳的乳汁中EPF检测时间，采集早、中、晚3个时间点的乳样进行检测，中午乳汁中的EPF检测结果与超声波检测法符合率最为接近[17]。基于不同的免疫学方法，EPF的检测时间和准确率都不同。故早孕因子作为早期妊娠检测仅限于小样本实验室检测，在规模化牛场中应用潜力不大。

1．4 类绒毛膜促性腺激素（类hCG）

奶牛精卵结合后，在发育成胚胎和胚盘的过程中，分泌的类绒毛膜促性腺激素（类hCG）将随乳汁和尿排出，因此检测尿液或乳汁是否存在类hCG，可以作为早孕诊断的一种依据[18]。

2 奶牛早期妊娠诊断的免疫学方法

2．1 放射免疫测定法

放射免疫测定法简称RIA，是一种结合同位素放射高度灵敏性和免疫学抗原抗体间结合的微量分析方法[19]。基于RIA，可以通过检测奶牛体内、血浆和乳汁中的孕酮水平判断奶牛是否怀孕[20]。Heap首次将结合竞争蛋白法改进为放射免疫分析法（二者均为放射性体外测定法，后者需制备特异性抗体，前者不需要抗体，灵敏度后者比前者高）。通过牛乳孕酮测定和卵巢评估结果对比发现，乳中孕酮浓度反映的发情周期阶段与卵巢评估结果一致[21]。史远刚等应用RIA法在奶牛配种22～24d测定乳汁中孕酮，结果妊娠确诊率为92.3%，未妊娠确诊率为100%[22]。苏妮等用同样的方法和标准对配种后21～26d的51头奶牛进行早期妊娠诊断，诊断总准确率为84.31%[23]。白云等采用RIA检测了85头奶牛人工授精后第7、16、22、45天血样和乳样中的孕酮水平，发现第7天时检测出的妊娠准确率和未孕准确率都比较低，不能作为早期妊娠检测的依据。而在16d和22d时，血液样本妊娠检测的准确率为84.38%和90.16%，乳样的妊娠检测准确率为85.94%和88.71%。这表明血液和乳汁中孕酮水平的平行[24]。

RIA还能通过测定糖蛋白（PAG）和早孕因子（EPF）来进行早期妊娠判断，且灵敏度已达0.2ng/mL，在奶牛人工授精28d后取得90%以上的妊娠诊断准确率[25,26]。虽然RIA法测定PAG的精确度和灵敏度高、检测速度快，但对实验设备条件和技术要求高、费时、有放射性危害，只能在专门实验室进行，因而不能普及。

2．2 胶体金免疫检测技术

在奶牛早期妊娠检测中，胶体金免疫检测技术是一种比较常见和快速的检测技术。从20世纪70年代开始兴起以来，胶体金在免疫学上的发展十分快速。该检测方法实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程[27]。将胶体金作为一种示踪标记物，检测抗原抗体特异性反应，具有检测速度快、使用方便、成本低廉等优点。通过胶体金夹心法研制的早孕试纸对早期妊娠诊断十分有效。万积成等将研制出的奶牛早孕诊断试纸应用于10家牛场的孕酮水平检测，结果表明最低检出量达5～8ng/mL，且无相关抗原交叉。该方法在奶牛配种后22～24d即可测定，孕牛阳性符合率为98.5%，阴性符合率为97.9%[28]。李志源等研制的奶牛孕酮半定量胶体金试纸条，能够在5min内完成检测，相比万积成的试纸，其阳性符合率较低（配种后22～26d的阳性符合率为85%），阴性符合率相差不大[29]。相比于其他免疫学方法，免疫胶体金检测技术在奶牛早孕检测上的应用有限，如美国仅公开了一种基于牛早期妊娠抗原的胶体金检测方法[30]。但由于应用该方法制成的胶条有效期长，检测稳定，故有较大的应用前景。

2．3 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA最早是由Dray等首先建立的又一早期妊娠诊断方法。此法简单易学、诊断迅速、无需昂贵的仪器设备、成本低、无放射性污染等[31]。该法原理是用酶标记孕酮或糖蛋白，作用于底物TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺），产生颜色反应，根据颜色深浅判断是否妊娠[32]。使用酶联免疫方法进行早期妊检的准确率和超声波检查法接近，但时间要提前几天。现已开发出敏感性和准确率均较高的奶牛孕酮诊断ELASA试剂盒，但成本较高。

Friedrich等和Green等使用ELISA检测受精28d奶牛血液中的PAG，获得较高的妊娠符合率，检测结果与35d超声波检测水平一致[33,34]。Sliva等使用ELISA法测定27d血清中的PAG浓度，结果早期妊娠诊断的准确率可以达到93.7%[35]。郭大智等建立的现场检测乳汁孕酮ELISA法，与直肠检查和产犊情况核对，未孕的诊断准确率为100%，已孕的准确率为95.3%[36]。杨国林等建立的目视ELISA测定孕酮的方法，对人工授精后19～23d奶牛已孕的判定准确率为79.22%，未孕的判定准确率为95.45%[37]。酶联免疫方法检测PAG和孕酮提供了一种有效可靠的妊娠诊断方法，同时还能保持生产水平，是一种有发展前途的方法。

EPF最重要的性质是没有种属特异性，故用ELISA法可以利用免疫小鼠制备的EPF抗体检测牛血清中的EPF[38]。权凯等利用该法检测奶牛血清中的阳性率与2个月后直肠检查和B超结果一致。ELISA法对检测EPF的准确率高，时间可在20d以内，但成本较高，抗体的制备过程较为繁琐，故在应用上有很大的难度[39]。

2．4 乳胶凝集抑制试验（LAIT）

LAIT是一种免疫测定法，可以用来检测乳汁或尿液中的类hcG和孕酮。在奶牛孕酮的早期妊娠检测中，是利用孕酮单克隆抗体和由孕酮包被的胶珠进行的乳汁孕酮快速测定[40]。此诊断方法操作简便，设备简单，成本也低，且可在圈舍进行现场操作。

凌志忠等利用LAIT检测两批黑白花奶牛尿液，妊娠准确率均在50%左右，空怀牛检测准确率均在87%以上[41]。刘深廷等用RIA、ELISA和LAIT法对配种后21～26d的奶牛进行了早孕诊断对比试验，诊断总准确率分别为84.31%（43/51）、85.45%（47/55）和92.31%（72/78）[42]。根据结果来看，LAIT法比RIA法和ELISA法的准确率要高。Romagno等也比较了LAIT法和ELISA法在奶牛早孕诊断上的灵敏性，结果发现LAIT法妊娠确诊率为84.7%，比ELISA法低，未妊娠确诊率为93.9%，较ELISA高[43]。LAIT法相对其他实验室检测手段具有灵敏性高、操作简单、容易掌握等特点，且可现场进行，在奶牛早孕诊断方法应用中有很好的前景。

表1 硫酸铜法诊断EPF的比较

2．5 硫酸铜法和玫瑰花环抑制试验

硫酸铜法和玫瑰花环抑制试验在奶牛早期妊娠诊断中主要是用于检测EPF。前者利用硫酸根能使EPF凝集的特性来分析牛乳中EPF含量。比较不同样本和试验条件下硫酸铜法的诊断结果见表1。表1显示，李山平等在22d左右的阳性符合率可达98%，而其他几组均达不到，可能是样本数较少的原因。陈龙等34d后阳性符合率到达85.45%，与其他组的结果相比略低，可能是由于在大规模牛场应用时试验条件所致。同时比较不同硫酸铜浓度对诊断结果的影响，可以看出5%的比3%的准确率要低。硫酸铜法在奶样储存上不方便，而且需肉眼判定结果，易受主观因素影响。

玫瑰花环抑制试验的原理是：把奶牛T淋巴细胞与另一种动物红细胞（RBC）混合后，淋巴细胞会呈玫瑰花形，在EPF检测中，应用该法如果玫瑰花环抑制滴度R值增加，则指示EPF存在[48]。精卵结合2～7d后，便可以通过玫瑰花环抑制试验检测出EPF活性，同时妊娠牛和未妊娠牛EPF值差异极显著[49]。玫瑰花环抑制试验测定已妊牛与未妊牛的EPF值，灵敏度高，最早在奶牛授精7d便可进行妊娠诊断，但检测时间长，所需药品试剂多，操作程序繁琐，不适合大批样本检测。

3 小结

目前，虽己建立很多奶牛早期妊娠诊断方法，但效果均不能满足现代奶牛养殖要求。直肠检查法和超声波检查法均不能满足18～21d内进行早期妊娠诊断，同时对技术和设备有一定的要求[50]。实验室方法近年来快速发展，能达到准确、灵敏的早期妊娠检测要求，但是存在耗时长、现场操作性不强等缺点[51,52]。目前已开发出多种针对早期妊娠诊断的试剂盒。奶牛PAG-ELISA妊娠检测试剂盒（爱德士公司）对人工授精后26～58d的奶牛妊娠诊断准确率能达到97.8%。应用层析式双抗体夹心法原理研制的奶牛早孕诊断试纸(北京万华生物工程有限公司)，对奶牛乳汁中孕酮最低检出量达5～8ng/mL，孕牛阳性临床符合率96.8%。还有研究出的奶牛早孕诊断试纸临床检测准确率达到93.4%。早孕试纸具有重要的经济意义和推广价值，在准确率和运用方面都非常有优势。随着生物免疫学的进步，将会有更多、更可靠的相关商品在奶牛早期妊娠诊断领域中脱颖而出，使发情鉴定及早期妊娠诊断发生革命性变化。

[1]Stevenson J S, Cartmili J A，Hensley B A, et al． Conception rates of dairy cows following early not-pregnant diagnosis by ultrasonography and subsequent treatments with shortened Ovsynch protocol[J]． Theriogenology, 2003,60(3)：475-483．

[2]Oltenacu P A, Ferguson J D, Lednor A J． Economic evaluation of pregnancy diagnosis in dairy cattle; A decision analysis approach[J]．J Dairy Sci,1990,73(10)：2826-2831．

[3]王利红,王守勋．奶牛的极早期(16±1d)妊娠诊断方法[J]．中国奶牛,2005,4：37-38．

[4]马国辅． 乳牛早期妊娠诊断六法[J]． 贵州畜牧兽医,2003,27(3)：42．

[5]Wisnicky W, Casida L E． A manual method for diagnosis of pregnancy in cattle[J]．J Am Vet Med A,1948,113(860)：151-452．

[6]Romano J E, Thompson J A，Kraemer D C，et al． Early pregnancy diagnosis by palpation per rertum; influence on embryo/fetal viability in dairy cattle[J]． Theriogenology,2007,67(3)：986-993．

[7]勒智勇．兽用超声多普勒仪在奶牛早期妊娠诊断中的应用[J]．青海大学学报,2008,26(2)：77-80．

[8]张慧茹,王爱华,马勇江,等．应用猪Ea花环抑制试验测定山羊和牛EPF活性[J]．西北农业学报,2002,11(1)：6-9．

[9]左海洋,陈晓丽,蔡勇,等． 奶牛早期妊娠诊断技术研究进展[J]．畜牧兽医学报, 2014,45(10)：24-31．

[10]祁生旺,黄祖干,刘俊平,等．怀孕奶牛和发情期奶牛乳汁中孕酮的检查[J]．内蒙古农业大学学报,1994,1：62-64．

[11]Kaneko J J，Harvey J W, Bruss M L． Clinical Bio chemistry of Dometic Animals[M]． Academic Press, 2008．

[12]Zoli A P． Demez p, Beckers J F, et al． Light and electron microscopic immunolocalization of bovine pregnanc-associated glycoprotcin in the bovine placentome[J]． Biol Reprod, 1992,46(4)：623-629．

[13]Ei-battawy K A, Sousa N M, Szenci O, et al． Pregancy-associated glycoprotcin profile during the first trimester of pregnancy[J]．Reprod Domest Anim,2009,44(2)：161-166．

[14]Ayad A,Sousa N M,Sulon J,et al． Comparison of five radioimmunoassay systems for PAU measurement： ability to detect early pregnancy in cows[J]． Reprod Domest Anim,2007,42(4)：433-440．

[15]Cavanagh A C． Identification of early pregnancy factor as chaperonin 10： implications for understanding its role[J]． Rev Reprod,1996,1(1)：28-32．

[16]Athannsna P S,Quinn K A, Wong T Y, et al． Passive immunization of pregnant mice against early pregnancy factor causes loss of embryonic viability[J]．J Reprod Fertil,1989,87(2)：495-502．

[17]李青旺,胡建宏,王立强,等．利用硫酸铜液诊断母牛早期妊娠技术初探[J]．中国农学通报,2005,20(6)：1-3

[18]王建勇,庄海,李荣杰,等． 血液早孕检测法在规模牛场应用效果分析[J]． 中国奶牛, 2014, 13：28-30．

[19]Lee J M, Lee H H, Park S, et al． Random Assay in Radioimmunoassay：Feasibility and Application Compared with Batch Assay[J]． Nucl Med Mol Imaging, 2016,50(4)：337-343．

[20]刘瑞生． 奶牛早期妊娠诊断研究进展[J]．中国奶牛, 2010,4：31-35．

[21]Heap, R． B．, Laing, J． A． The concentration of progesterone in the 1k of cows during the reproductive cycle[J]． Br Vet J．, 1971,127： 616-620．

[22]史远刚, 吴颖慧, 周乐, 等． 奶牛早孕诊断乳汁孕酮临界值的确定[J]． 黄牛杂志, 1996, 4：26-29．

[23]苏妮,孙振师,张华恒．奶牛三种早孕诊断方法的比较[J]．山东畜牧兽医,2012,33(4)：17-18．

[24]白云． 奶牛四种妊娠诊断方法与结果的比较[D]．石河子：石河子大学,2013．

[25]Zoli A P, Beckers J F, Wouters B P, et al． Purification and characterization of a bovine pregnancy-associatcd glycoprotcin[J]．Biol Reprod,1991,45(1)：1-10．

[26]Ayad A,Sousa N M,Sulon J,et al． Comparisonof five radioimmunoassay systems for PAG measurement： ability to detect early pregnancy in cows[J]． Reprod Dourest Anim，2007,42(4)：433-440．

[27]Chandler J, Gurmin T, Robinson N． The Place of Gold in Rapid Tests[J]． IVD Technology,2000, 6(2)：37-49．

[28]万积成,万志静,唐晓宾,等． 奶牛早孕诊断试纸条的研制及临床试验[J]． 中国奶牛,2007,12：22-25．

[29]李志源．奶牛孕酮半定量检测胶体金试纸条的研制[D]．天津： 天津农学院, 2012．

[30]Roth J W,Colgin M,Hurst R,et al． Bovine pregnancy test： US,7393696[P]． 2008-07-01．

[31]Dray F, Andrieu J M, Renaud F． Enzyme immunoassay of progesterone at the picogram level usingbeta- galactosidase as label [J]． Biochim Biophys Acta．, 1975,403(1)：131-138．

[32]左海洋,陈晓丽,蔡勇,等． 奶牛早期妊娠诊断技术研究进展[J]．畜牧兽医学报, 2014, 45(10)：24-31．

[33]Friedrich M, Holtz W．Establishment of an ELISA for measuring bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection[J]．Reprod Dourest Anim,2010,45(1)：142-146．

[34]Green J C, Newsom E M, Lucy M C．Incorporation of a rapid pregnancy-associated glycoprotein ELISA into a CIDROvsynch resynchronization program for a 28 day re-insemination interval[J]． Theriogenology,2011,75(2)：320-328．

[35]Silva E,Sterry R A,Kolb D, et al． Accuracy of pregnancy-as-sociated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after timed artificial insemination[J]． J Dairy Sci,2007,90(10)：4612-4622．

[36]郭大智．现场诊断奶牛早孕与发情的酶免疫分析法的改进[J]．四川畜牧兽医, 2001,28(2)：18-19．

[37]杨国林,熊三友,牛建荣,等． 目视 ELISA 测定孕酮的研究及其应用[J]．中国兽医科技,1998,28(8)：28-29．

[38]Koch E, Ellendorff F． Prospects and limitations of the rosette inhibition test to detect activity of early pregnancy factor in the pig[J]．Reprod uction,1985,74(1)：29-38．

[39]权凯,张改平．应用Ea玫瑰花环抑制实验检测奶牛血清EPF活性[J]． 中国奶牛,2008,6：29-31．

[40]包凯,曹宇,刘光磊,等． 奶牛的早期妊娠诊断研究进展[J]． 现代畜牧兽医, 2016, 8：54-57．

[41]凌志忠 ,李大铁 , 陈韶让 ． LAIT 技术对牛孕检的初步研究[J]．中国兽医杂志 ,1992,18(8)：15-16．

[42]刘深廷,徐希军,李忠平． 诊断奶牛早孕的三种方法比较[J]．中国兽医科技,1994,24(12)：37-38．

[43]Romano J E,Thompson J A,Forrest D W, et al． Early pregnancy diagnosis by transrectal ultrasonography in dairy cattle[J]．Theriogenology, 2006, 66(4)：1034-1041．

[44]李山平,白勇,刘卫国,等．应用硫酸溶液对奶牛进行早期妊娠诊断[J]．黑龙江畜牧兽医,1997,2;32-33

[45]郑昌乐,胡春山,姜惠杰,等． 奶牛早期妊娠硫酸铜法诊断试验[J]． 中国奶牛, 1990, 2：48-49．

[46]陈龙． 硫酸铜法对牛早期妊娠诊断的效果观察[J]． 青海畜牧兽医杂志, 2011, 41(4)：58-60．

[47]李青旺,胡建宏,王立强,等． 利用硫酸铜液诊断母牛早期妊娠技术初探[J]． 中国农学通报, 2004, 20(6)：8-10．

[48]李雅茹,刘绪川, 张国伟． 应用玫瑰花抑制试验诊断奶牛早期妊娠的研究[J]．中兽医医药杂志,1988,2：19-20．

[49]张慧茹,王爱华,马勇江,等．应用猪Ea花环抑制试验测定山羊和牛EPF活性[J]．西北农业学报, 2002,11(1)：6-9．

[50]Fricke P M． Scanning the future-ultrasonography as a reproductive management[J]．J Dairy Sci, 2002,85(8)：1918-1926．

[51]Jin D I,Lee H R,Kim H R,et al． Proteomics analysis of pregnancy-specific serum proteins in bovine[J]．Reprod Fert Dev,200,18(1-2)：183．

[52]Han R,Kim H R,Naruse K,et al． Identification of bovine pregnancy-specific milk proteins using proteomics[J]．Biol Reprod,2008,78(143)：379．

Abstract:With the development of large-scale dairy farming intensification deepened, pregnancy inspection requirements before 30 days to achieve high accuracy, but the early pregnancy diagnosis method now was not up to the requirements. In this paper, the advantages and disadvantages of different methods for the diagnosis of early pregnancy were compared, in order to provide the direction for the development and research of early pregnancy diagnosis.

Key words:Cow; Immunology; Early pregnancy diagnosis

Advance of Immunology Technology in Early Pregnancy Diagnosis of Dairy Cows

LI Xiao-lin1, LIU Chang-bin1,2
(1.Shihezi University, Shihezi 832003; 2.Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi 832003)

S823.3

A

1004-4264（2017）09-0024-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.007

2017-01-19