微束X射线荧光和X射线吸收近边结构谱分析云南某铅锌矿区苔藓中铅的分布和形态

宋玉芳 沈亚婷 ��

摘要苔藓对重金属胁迫具有良好耐受性和一定的积累能力。本研究采集并测定了铅锌矿区苔藓和苔下土壤中重金属元素含量，利用微束X射线荧光光谱（MicroXray fluorescence spectrometry， microXRF）测定了苔藓中重金属元素的分布，采用X射线吸收近边结构（Xray absorption near edge structure， XANES）分析了苔藓中Pb的元素形态。研究表明，矿区苔藓具有较强的Pb、Zn、Cd、As积累能力，Pb和Zn最高含量可达1.06和1.23 mg/g， Cd和As最高含量可达30.5和13.2 μg/g。苔藓地上部（尤其是新生组织）是苔藓吸收并积累重金属的主要部位；矿区采集的小灰藓和匍枝青藓中部分金属元素分布规律不同，反应了不同苔藓种属对金属元素的吸收、积累和耐受机制的差异。XANES结果显示，Pb在小灰藓中主要以Pb3（PO4）2形态存在（约78%），表明生成Pb3（PO4）2沉淀可能是苔藓对Pb的耐受机制之一。

[KH*3/4D][HTH]关键词苔藓； 铅锌矿； 铅； 植物修复； 微束X射线荧光； X射线吸收近边结构； 微区分布； 形态

1引 言

重金属污染是目前最严重的环境污染问题之一，矿山开采等人为活动一直是重金属污染的重要来源。近年来随着铅锌矿勘探、开采规模增加，全球由于采矿和冶炼活动排放到环境中的Pb高达6.35×105 吨/年。云南拥有我国最大的铅锌矿，且80%为露天矿石开采[1]，大量矿物颗粒随着大气飘尘进入矿区周围环境中，成为矿区污染的重要来源之一。

露天开采的铅锌矿区大气中通常存在大量富含Pb等重金属的微细颗粒物[2]，可随呼吸、消化等途径进入人体，造成人体机能损伤。据报道，粒径为0.1～1 μm的铅尘在呼吸道中的沉降率约为35%，沉降后的14天内，高达90%以上的Pb可被吸收，通过呼吸道途径和消化道途径摄入的土壤和灰尘的铅暴露量占总铅暴露量的52.0%[3]。被人体摄取的Pb会对神经系统、血液系统、消化系统以及生殖系统造成损伤。

植物修复重金属污染作为新兴的绿色环保技术，具有经济、生态友好等优势。苔藓特殊的细胞结构和独特的元素吸收、存储方式，使它能够高效吸收大气沉降和土壤中的重金属[4]。首先，苔藓叶片是单层细胞结构，叶表有尺寸为5～15 μm的不闭合孔状结构，且无蜡质角质层覆盖[5]，易于重金属进入；其次，多毛分支结构使苔藓的表面积与体积比约为维管植物的5～10倍，与环境接触面积广；此外，苔藓根系仅在植物体末端起固着作用，苔藓中营养物质及重金属元素主要来源于叶表面对干湿大气沉降物的吸收[6]，但也有报道苔藓可从土壤等基质中吸收元素；最后，苔藓具有对重金属的耐受和积累能力，有研究发现苔藓耐受并富集Pb的能力强，喷洒低浓度Pb2+溶液（0.2 mmol/L）进行短周期（7 d）胁迫，匍枝青藓植株中Pb元素富集量高出对照组29倍，3.0 mmol/L Pb2+胁迫剂量胁迫28 d匍枝青藓正常生长，且植株中Pb积累量高达2219 μg/g[7]。正因为苔藓的以上生理结构等优势，苔藓具有很强的吸附保留重金属的能力，可用于矿区大气和土壤中重金属的修复治理[8]。

目前，对Pb在苔藓中的耐受和解毒机制的报道较少，有研究运用荧光显微镜观察重金属胁迫下的苔藓微观结构，发现毒性元素Pb主要积累在藓类植物原丝体尖端的细胞壁增厚物中，并影响细胞壁成分的含量[9]，结合连续洗脱和超微结构观察发现，储存量仅占5%的胞内Pb元素对苔藓生理生化影响最大[10]。

微束X射线荧光光谱分析技术可获得微米级聚焦光斑，对植物样品进行微区扫描后，可得到植物中主元素和微量元素的空间分布信息，利用同步辐射X射线吸收近边精细结构可获得元素的价态和化合物组成信息[11，12]。如将microXRF和XANES技术联合应用于拟南芥幼苗中Pb的分布和根际土壤中Pb的形态特征，可以揭示拟南芥Pb中毒的主要原因[12]。

本研究通過测定铅锌矿区苔藓及其苔下土壤中的重金属含量，利用微束X射线荧光光谱仪测定苔藓中Pb、Zn等元素的微区分布，同时使用XANES分析苔藓中的Pb的存在形态，探讨铅锌矿区苔藓的重金属积累能力和苔藓中元素的分布储存特征，揭示苔藓对Pb的吸收和耐受机制。

2实验部分

2.1仪器与试剂

microXRF、XANES（上海光源BL14W1），7500a电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS， Agilant公司），OES 8300电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICPAES， Perkin Elmer公司）。生物成分分析标准物质GSB6、GSB1、GSB7；土壤成分分析标准物质GBW07436、GBW07437、GBW07438。HNO3（BVⅢ），H2O2、 HCl、 HClO4、 HF均为优级纯。XANES标样：Pb3（PO4）2、PbO、Pb3O4、Pb（OH）2、C3H9ClPb、PbS、Pb5（PO4）3Cl、（C17H35COO）2Pb等购于阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2样品采集与制备

2014年8月，在云南某铅锌矿区的矿堆、废气排放口、矿渣堆放点等位置设置典型采样点，采集苔藓及苔下土壤，用自封袋封装，平铺于工具箱内并避免叠压，运回实验室。

取新鲜苔藓下土壤，冷冻干燥12 h后，挑出土壤中的杂物，研磨过200目尼龙筛，烘干至恒重。称取0.0500 g土壤粉末样，用HClHNO3HClO4HF四酸消解法消解，用于ICPAES分析。

将苔藓用自来水反复冲洗多次，超声振荡30 s，去离子水冲洗3遍后，冷冻干燥12 h，用研钵研磨至均匀粉末状，置于40℃烘箱内恒重12 h。称取0.5000 g均匀粉末样品， 用HNO3H2O2体系在聚四氟乙烯消解罐中消解后，用去离子水稀释500倍，用于ICPMS分析。endprint

将清洗后的单株苔藓鲜样，粘在无硫胶带上并固定于样品托，用于microXRF分析。

将清洗后的小灰藓样品冷冻干燥后，用液氮辅助将具有完整叶、茎和假根的小灰藓植株碾成粉末状，在压片机下压成直径10 mm，厚度0.8 mm圆片，用于苔藓中Pb的L3边XANES形态分析。

2.3样品分析和质量控制

分别使用ICPAES和ICPMS测定土壤和植物样品中的元素含量。分别使用GBW07404、GBW07405、GBW07406 3种土壤标样和GSB6、GSB1、GSB7 3种植物标样，设置3个重复样及3组空白对照，对分析方法和整个分析流程进行质量监控，两种方法回收率分别为94%～103%和80%～120%。

使用国家地质实验测试中心自主研发的microXRF（图1）观察元素微区分布，采用聚束毛细管透镜（Powerflux PF XBeam， Xray optical systems， inc. USA）对X射线进行聚焦，阳极靶材为铑靶，功率50 W，利用刀片测的实际焦斑大小为30 μm×30 μm，焦距4 mm。探测器为硅漂移探测器（Silicon drift detector， SDD），内置热电制冷器制冷，室温下在5.9 keV处分辨率为130 eV （谱峰半高宽， Full width high maximum， FWHM） （Vortex EX60 SDD， SII NanoTechnologh USA Inc）[14]。聚焦X射线光管和探测器呈45°放置于三维控制样品台上方，样品放置在三维自控滑台上，通过计算机控制滑台驱动器使样品移动，实现样品的二维扫描。经铜箔进行microXRF能量刻度的标定和校正后，对样品进行300 s单点采谱，确定各元素无干扰特征谱线，圈定微区分布分析时各元素感兴趣区，通过预扫描确定样品边界后，进行精密扫描。激发电压48 kV，电流0.8 mA，谱采集时间30 s，纵向步长50 μm、横向步长25 μm。

在中国科学院上海应用物理研究所的同步辐射X射线吸收精细光束线（BL14W1）进行Pb的L3边（13.035 keV）XANES测定。储能环能量3.5 GeV，环电流120～200 mA，Si（111）双平晶单色器，能量步长设置为0.5 eV，采谱范围为

Symbolm@@ 80～200 eV，32元硅漂移固体探测器，用Pb箔校准能量。所有Pb标准化合物均经过碾磨后涂抹在荧光胶带， 并用透射模式测定，待测样品由于Pb含量较低，经过粉末压片后用荧光模式测定。

2.4数据处理

采用Origin8.0，SPSS19.0绘制重金属含量图并进行相关性分析。使用PyMca软件对X射线荧光谱图进行能量矫正和背景扣除。使用Athena软件进行XANES谱图的能量校准、归一化和线性拟合。

3结果与讨论

3.1矿区苔藓吸收和积累重金属的能力及影响因素

苔下土壤中Pb和Zn平均含量分别为2.25和8.23 mg/g，As和Cd的平均值分别为0.216和0.121 mg/g，如图2所示，研究区域土壤中Pb、Zn、As和Cd含量均超过了土壤环境质量三级标准。矿区苔藓中Pb和Zn平均含量分别为0.268和0.506 mg/g，最高可达1.06和1.23 mg/g； Cd和As平均值为13.0和5.4 μg/g，最高可达30.5和13.2 μg/g（圖3）。可见苔藓具有较强的重金属吸收和积累能力。

对分别收集的7组苔藓及根际土壤进行重金属相关性分析（表1）， Cd和Zn的Pearson相关系数分别为0.84和0.82，显著相关；As和Pb相关系数分别为0.52和0.39，中度相关。这表明苔藓中Cd和Zn的主要来源可能是土壤，而As和Pb则可能是其它来源，如大气沉降。对英国过去150年的苔藓样本进行元素浓度的主成分分析，发现大气沉积是元素Pb和Cu的主要来源[15]。张元勋等[16]也发现苔藓植株体内的Pb和Ni元素浓度和PM2.5大气颗粒物中元素浓度存在很好的相关性。

3.2苔藓中重金属的分布

用microXRF测定元素分布之前，需要对样品单点采谱，识别样品中存在的元素，识别元素之间的干扰，获取元素感兴趣区。待测苔藓样品中，主要含有K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Pb等元素（图4）。受X射线能量探测器分辨率的影响，K和Ca、Mn和Fe、Cu和Zn间的K

SymbolaA@ 和K

SymbolbA@ 间存在谱线重叠。其中，元素K的Kβ（3.59 keV）与元素Ca的Kα（3.69 keV）存在重叠干扰，分别选定元素K的Kα（3.31 keV）与元素Ca的Kα（3.69 keV）进行测定，感兴趣分别圈定K（3.18～3.48 keV），Ca（3.56～3.95 keV）；元素Mn的Kβ（6.49 keV）与元素Fe的Kα（6.41 keV）存在重叠干扰，分别选定元素Mn的Kα（5.90 keV）与元素Fe的Kα（6.41keV）进行测定，感兴趣分别圈定Mn （5.67～6.14 keV），Fe（6.16～6.74 keV）；元素Cu的Kβ（8.90 keV）与元素Zn的Kα（8.64 keV）存在重叠干扰，分别选定元素Cu的Kα（8.05 keV）与元素Zn的Kα（8.64keV）进行测定，感兴趣分别圈定Cu （7.81～8.24 keV），Zn（8.28～9.01 keV）。由实测的苔藓microXRF能谱图（图4）可见，K、Mn、Cu特征峰强度很弱，对Ca、Fe和Zn的重叠干扰较小，在元素分布特征的比较中贡献率低，因此在对苔藓进行microXRF分布扫描时，未予扣除。如果要进行浓度分布的比较，则应在建立校正曲线时，采用扣除背景和干扰的净强度作为定量分析的基础，并结合标准物质进行基体效应的校正。根据圈定的感兴趣区，利用microXRF分别对具有完整叶、茎和假根的单根小灰藓（图5）和二岐分枝的匍枝青藓分叉点以上部位进行微区扫描（图6），获得了苔藓中的元素分布特征。endprint

从单根小灰藓元素microXRF分布图（图7）可见，K、Ca、Fe、Mn、Pb、Zn等均积累在灰藓中的新生绿色尖端部分，且呈由叶片边缘向中肋分布明显增加的趋势，元素在栉片中聚集。文献[17]报道， 中肋表面突起状组织栉片是由厚壁细胞组成，苔藓在PbCl2胁迫下具有将Pb2+隔离在该组织细胞壁的功能。图7还表明，K、Ca和Pb在小灰藓根部积累，但茎中分布较少。小灰藓的元素分布特征表明， 地上部特别是新生组织可能是其储存重金属的主要部位，而Pb在小灰藓根部的积累来源于根部吸收， 还是沉降吸收的向下输送， 尚需进行深入探索。与小灰藓不同，匍枝青藓的元素分布（图8）显示，Cu、Zn主要积累于匍枝青藓的二岐分枝叶基包裹主茎处，特别是端部；K、Mn、Fe、Pb主要积累于二岐分枝基部，K、Pb在主茎处也有部分分布。此外，由于K、Ca相互重叠，而K峰很弱、Ca峰很强，因此K、Ca的相关性不排除由于谱峰重叠对K产生了部分影响。

对比铅锌矿区小灰藓和匍枝青藓中的元素分布特征可以发现，Zn和Pb在两种苔藓中的分布特征一致，Zn主要位于新生组织的端部，Pb在两种苔藓的端部和基部均有积累；Fe、Mn的分布规律则完全相反，分别积累于端部和基部。分布规律异同，反映了不同苔藓种属对铅锌矿区金属元素的吸收、积累、耐受机制的差异，值得进一步探索。

3.3Pb的形态分析

为进一步探索苔藓吸收和耐受重金属机制，需要开展Pb在苔藓中形态特征研究。目前，对苔藓中的Pb的储存和解毒机理的报道有限，已有研究显示，

形成PbS配体可能是小羽藓的一种重要解毒机制，曹清晨等[18]采用XANES技术分析暴露

以胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽形态存在的低价态硫的总相对含量增加，间接说明含硫配体的络合可能参与铅的解毒机制。但是目前关于重金属赋存形态在其它苔藓种类解毒机制中发挥的作用尚未有报道。

利用XANES的谱图经能量校准和归一化后， 在

Symbolm@@ 20～70 eV内拟合，结果如图9所示，Pb3（PO4）2和PbO分别占78%和22%（图9），R因子为0.000032。数据表明，小灰藓中Pb主要以Pb3（PO4）2的形式存在，这可能解释了小灰藓对Pb的积累和耐受原因。对于大多数植物，体内生成Pb3（PO4）2沉淀是常见的解毒机制之一。如有研究用XANES和透射电子显微镜能谱（Transmission electron microscopeenergy dispersive spectrometer， TEMEDX）分析技术证实Pb3（PO4）2是模式植物拟南芥、玉米和田菁中铅的主要成分[19，20]。可见，生成Pb3（PO4）2沉淀可能也是苔藓的一种解毒机制。

4结 论

本研究从化学分析和原位微区分析的角度，综合运用ICPMS、ICPAES、microXRF和XANES等分析手段，开展了我国铅锌矿区苔藓中重金属元素含量、分布和形态特征研究，发现苔藓样品中Pb、Zn、Cd和As含量较高，部分样品可高达1.06 mg/g （Pb）、1.23 mg/g （Zn）、30.5 μg/g （Cd）、13.2 μg/g （As），证实该地区生长的苔藓具吸收和积累重金属的能力。苔藓的microXRF结果表明， 高浓度重金属元素和植物营养元素主要积累在苔藓地上部顶端部位，揭示叶端新生组织是苔藓贮藏重金属元素的主要部位。研究表明，灰藓中的Pb主要以Pb3（PO4）2的形式存在，可能是灰藓积累和耐受Pb等重金属的原因之一。鉴于苔藓种类多，对不同重金属的吸收和积累机理可能存在差异，且影响其吸收的外界因素很多，所以在microXRF和XANES的基础上，结合更多分析技术，如X射线荧光技术、X射线荧光微探针技术和微区显微成像技术等，开展多种属苔藓组织细胞亚细胞水平的元素分布及毒性元素的赋存形态研究，可以为开展铅锌矿区苔藓对土壤和大气的植物修复提供进一步的理论支持。

致 谢衷心感谢中国地质科学院国家地质实验测试中心罗立强、上海光源14W1线站黄宇营在微区测定及形态分析方面给予的指导和帮助；同时对曾远、柳检在实验过程中给予的帮助表示衷心感谢。

References

1LI RuiPing， WANG AnJian， CAO DianHua. Geol. Rev.， 2009， 1（55）： 126-133

李瑞萍， 王安建， 曹殿華. 地质论评， 2009， 55（1）： 126-133

2ZHOU Li， SHI GuiYong， FU Yu. Rock Mineral Anal.， 2016， 35（3）： 302-309

周 莉， 石贵勇， 付 宇. 岩矿测试， 2016， 35（3）： 302-309

3HAO HanZhou， CHEN TongBin， WU JiLiang. Enviromen. Sci.， 2012， 33（6）： 2075-2082

郝汉舟， 陈同斌， 吴基良. 环境科学， 2012， 33（6）： 2075-2082

4Lambe B， Marina V， Frontasyeva， Trajcˇe S， Robert ， Ostrovnaya T M. Environ. Sci. Pollut. R， 2015， 22（20）： 16077-16097

5Mashuri W， Lawren S.New Phytol.， 2010， 185（1）： 156-172

6Markert B. J.Trace Elements Med. Biol.， 2007， 21： 77-82

7Lou Y X， Zhang Y X， Yu Y H， Cao Y， Cao T. Acta Scientiae Circumstntiae， 2011， 31（1）： 193-198endprint

8Ake R， Germund T. Environ. Pollut.， 2004， 131（3）： 417-423

9Magdalena K， Marta L， Ewa J. Environ. Experimental Botany， 2009， 65（1）： 119-131

10Basile A， Sorbo S， Pisani T， Paoli L， Munzi S， Loppi S. Environ. Pollut.， 2012， 166（1）： 208-211

11ZENG Yuan， LUO LiQiang. 分析化學， 2016， 44（9）： 1372-1377

曾 远， 罗立强. 分析化学， 2016， 44（9）： 1372-1377

12Lin J Z， Jing Z， Jian Y Z. J. Synchrotron Radiat.， 2016， 23（3）： 758-768

13Shen Y T， Song Y F. J. Synchrotron Radiat.， 2017， 24（2）： 463-468

14LUO LiQiang， SHEN YaTing， MA YanHong.Spectrosc. Spect. Anal.， 2017， 37（4）： 1003-1008

罗立强， 沈亚婷， 马艳红. 光谱学与光谱分析， 2017， 37（4）： 1003-1008

15Shotbolt L， Buker P， Ashmore M R.Environ. Pollut.， 2007， 147（1）： 120-130

16ZHANG YuanXun， CAO Tong， YANG ChuanJun， WANG Min.Nuclear Techniques， 2007， 30（9）： 730-734

张元勋， 曹 同， 杨传俊， 王 敏. 核技术， 2007， 30（9）： 730-734

17Harry H， Norrisa D A， Koerbera G R， Alan B， Eiliv S， Ke R. Environ. Pollut.， 2007， 151（2）： 368-376

18CAO QingChen， LOU YuXia， ZHANG YuanXun. Environ. Sci.， 2009， 30（2）： 3663-3668

曹清晨， 娄玉霞， 张元勋. 环境科学， 2009， 30（2）： 3663-3668

19Shen Y T. XRay Spectrom.， 2014， 43（3）： 146-151

20Sahi S V， Bryant N L， Sharma N C， Singh S R. Environ. Sci. Technol.， 2002， 36（21）： 4676-4680

Distribution and Speciation of Lead in Moss Collected from a LeadZinc

Mining Area by MicroXRay Fluorescence and XRay Absorption

Near Edge Structure Analysis

SONG YuFang1，2， SHEN YaTing*1，3

1（National Research Center for Geoanalysis， Beijing 100037， China）

2（China University of Geosciences （Wuhan） Faculty of Materials Science and Chemistry， Wuhan 100083， China）

3（Key Laboratory of Ecological Geochemistry， Ministry of Land and Resources， Beijing 100037， China）

AbstractMoss has high tolerance and accumulating capacity to heavy metal. In this study， the distribution of heavy metal elements in moss sampled from leadzinc mine was analyzed by Xray fluorescence spectrometry. The speciation of lead was analyzed by Xray absorption nearedge spectroscopy. Research showed that the contents of Pb， Zn， Cd and As in the moss of the mining area were extremely high， and their maximum concentration were 1.06 mg/g ， 1.23 mg/g， 30.5 μg/g， 13.2 μg/g， respectively. Besides， the shoots especially the new tissue of the moss were the major sites for accumulation and storage of heavy metals. The microdistribution characteristics varied among Hypnum plumaeforme and Brachytheciumprocumbens， indicating the difference of different species of moss in absorption pathway， accumulation and tolerance mechanisms for heavy metal. Linear combination fitting results indicated that the main lead speciation in moss was lead phosphate （78%） and lead oxide （22%）， which suggested that the precipitation of lead phosphate might be the main mechanism of tolerance for moss.

KeywordsMoss； Leadzinc mine； Lead； Phytoremediation； MicroXray fluorescence； Xray absorption near edge structure； Microdistribution； Speciation

（Received 13 April 2017； accepted 12 June 2017）

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China （No. 2016YFC0600603）， the National High Technology Research and Development Program of China （No. 2007AA06Z124）， the China Geological Survey Projects（No.DD20160340） and the Fundamental Research Funds for the Chinese Academy of Geologecal Sciences （No.YYWF201620）endprint